CHIP(1)_PPT课件新完整版.pptx

染色质免疫沉淀及其测序

seg

王雅琪

目录

简介

技术原理

技术流程

应用

优缺点

测序

·ChIP

是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。不仅可以检测体内反式因子与DNA的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基

因表达关系。

简介

染色质免疫沉淀技术

(chromatin

immunoprecipitationassay,

ChIP)的基本原理是在活细胞状态下把细胞内的蛋白质和DNA交联，超声波将其随机

切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后用所研究的目的蛋白质特异性抗体免疫沉淀蛋白质-DNA复合体，从而特异性地富集目的蛋白结合的

DNA片段。

ACTGGTGACAGGACG

SequenceDNA

tragmentandmap

togenome

ReverseCrosslinks,

PurtyDNAandprepare

forsoquencing

二、原理

Immunoprecipitate

andpurtycomplexes

CrosslinkProteinandShearDNA

AddProtein-

SpectfcAntibody

CellNucleus

|

外铂近甲柴美

完整的活体细胞

固定细胞

线/邀光

等

交联的蛋白质-DNA

染色/质片段化

超声波降解

核酶消化

制性丙切酶

片段化的染色质

●特意性抗体

鲁免疫吸附剂

免疫结合和免疫沉淀

沉淀(结合的蛋白质-pNA)上清(集结合的蛋自质-DMA)

逆转交联

DNA纯化

DNA分析

常用分析方法

逆转交联

DNA纯化

PCR/Real-timePCR

SouthernBlotAnalysisChIP-Cloning

CNTP-Mieroarray

DNAFeotprinting

技术示意图

染色质免疫沉淀(ChIP)技术示意图

●●●老

交联，裂解细胞

超声

L免疫沉淀

解交联，并纯化富集的DNA

具体操作流程

三、技术流程

室温10-20min

■--

预冷1×PBS

洗涤两次

4-5ml预冷1×PBSJ

转移

弃上清

4000rpm

离心5min

4000rpm

离心5min

1ml预冷

1×PBS

悬浮

新离心管

1、甲醛交联细胞

具体步骤

1ml1.25mo1E

10mll×PBS

弃上清

帝老作作量

2、染色质超声断裂

■1.加SDS裂解溶液重悬浮沉淀，冰上10min。

每1min颠倒摇动一次离心管。

2.把DNA粉碎为长度200-1000bp,置于冰

上。(不同样本都进行超声条件优化实验)3.14000rpm离心10min(4℃),转移上清于1.5ml离心管。

3、免疫沉淀蛋白和DNA复合物

ChIP稀释液稀超声染色质液体

释10倍

2ml超声稀释液

A/G琼脂糖珠

4℃摇床摇动一小时

1-4μl免疫沉淀抗体

1000rmp离心2min(4℃)

取50μl上清液作为对照

转移上清液至新离心管

加入20μl蛋白

a低盐洗脱溶液1ml洗一次b高盐洗脱溶液1ml洗一次c氯化锂洗脱溶液1ml洗一次dTE溶液(pH8.0)1ml洗两次

4、收获免疫复合物(抗体-蛋白质-DNA)

每次洗时，在摇床上摇10min,4℃,

4000rpm离心

5min

1×PBS洗3次离心1000rpm,1min.弃上清，

用4μl1×PBS悬浮

样品

摇动1-2h,4℃

40μlProtein

A/GAgarose

Beads

1000rpm,离心5min,4℃弃上清

Beads

摇床上摇动10min

12000rpm离心1min

5、洗脱免疫复合物

取上清十

200μl,ChiP洗脱溶液

(3次)

200μlChIP洗脱

溶液洗脱

取上清800μl洗脱液

Beads

6、去除甲醛交联

解交联：加入20ul5MNaCl(NaCl终浓度

为0.2M).混匀，65℃,解交联过夜。

1酚-氯仿抽提

硅胶柱纯化

8、染色质免疫共沉淀DNA的分析和

蛋白质在DNA上结合位点的鉴定

1.如果目的蛋白靶序列已知，或怀疑某一序列是目的的蛋白靶序列，则可选用定量或者半定量PCR方法。

2.如果目的蛋白的靶序列未知或者研究目

的蛋白基因组分布情况，找出转录因子结合位点，则可采用ChIP克隆测序，Ch