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降血糖动物实验

辅助降血糖作用检验方法

1动物实验

1.1动物选择

选用健康成年动物，常用小鼠（25±2g）或大鼠（180±20g），单一性别，大鼠每组8-12只、小鼠每组10-15只。

1.2材料

1.2.1试剂

四氧嘧啶（或链脲霉素）小鼠35-50mg/kg.bw.iv（100-160mg/kg.bw.ip）、大鼠50-80mg/kg.bw.iv（200-250mg/kg.bw.ip）用新鲜配制。

血溏测定试纸或试剂盒。

1.2.2仪器

血糖仪、全自动生化仪、721-B型分光光度计。

1.3剂量分组及受试样品给予时间

设1个溶剂对照组和3个受试样品剂量组，根据人体每日每公斤体重推荐摄入量，小鼠扩大10倍作为其中一个剂量组（大鼠扩大5倍），根据受试样品的具体情况另设两个剂量组。受试样品给予时间原则上不少于30天，也可根据实验需要自行设定期限。

1.4实验方法

1.4.1降低空腹血糖实验

1.4.1.1高血糖模型动物

1.4.1.1.1原理

四氧嘧啶（或链脲霉素）是一种β细胞毒剂，可选择性地损伤多种动物的胰岛β细胞，造成胰岛素分泌低下引起实验性糖尿病。

1.4.1.1.2造型

动物禁食24小时后，给予四氧嘧啶造型，5-7天后禁食3-5小时，测血糖，血糖值10-25mmol/L为高血糖模型成功动物。

1.4.1.1.3操作步骤

选高血糖模型动物按禁食3-5小时的血糖水平分组，随机选1个模型对照组和3个剂量组（组间差不大于1.1mmol/L）。剂量组给予不同浓度受试样品，模型对照组给予溶剂，连续30天，测空腹血糖值（禁食同实验前），比较各组动物血糖值及血糖降低的绝对值（即实验前后血糖的差值）。

1.4.1.2正常动物

选健康成年动物按禁食3-5小时的血糖水平分组，随机选1个对照组和1个受试样品组（高剂量）。余操作同1.4.1.1.3。生成红色醌类化合物，可在波长505nm比色测定。

2试剂配制

磷酸盐缓冲液（0.2mol/L,PH7.0）

0.2mol/LNa2HPO461ml，0.2mol/LKH2HPO439ml混合即可。

酶试剂

葡萄糖氧化酶400u，过氧化物酶0.6mg,4-氨基安替比林10mg，叠氮钠100mg加磷酸盐缓冲液至100ml，PH调至7。冰箱存放至少可稳定2个月。

酚试剂

酚100mg溶于100ml蒸馏水中。

酶混合试剂

取等量酶试剂和酚试剂混合。在冰箱中可存放1个月。

葡萄糖标准液

储存液：无水D-葡萄糖（A.R.）在烤箱中80℃烤4小时，冷却后，存放于干燥器中至恒重。精确称取2g以0.25%苯甲酸溶液溶解并移入100ml容量瓶中，再用苯甲酸溶液稀释至100ml。

应用液：在100ml容量瓶中准确加入储存液5ml，再用0.25%苯甲酸溶液稀释至100ml，即1mg/mL应用液。

蛋白沉淀剂

溶解磷酸氢二钠10g、钨酸钠10g、氯化钠9g于800ml蒸馏水中，加入1mol/L盐酸125ml，并用蒸馏水稀释至1000ml。

3操作步骤

取蛋白沉淀剂1ml加入血浆（血清）50ul混匀。室温放置7分钟后，离心，取上清液（无蛋白血滤液）测定。葡萄糖标准应用液亦进行同样处理。

测定管

标准管

空白管

无蛋白血滤液mL

0.5

-

-

处理后的葡萄糖标准液mL

-

0.5

-

蛋白沉淀液mL

0.5

酶混合试剂mL

4

4

4

混匀后，37℃水浴保温15分钟，用空白管调零点，在波长505nm处比色。

4结果计算

2人体试食试验

2.1试验设计

试验采用随机分组，组间和自身两种对照设计。

2.2受试产品

受试产品必须是具有定型包装、标明服用方法服用量的定型产品；安慰剂除功效成分外，在剂型、口感、外观和包装上与受试产品保持一致。

2.3受试者选择

2.3.1纳入标准

选择经饮食控制或口服降糖药治疗后病情较稳定，不需要更换药物品种及剂量，仅服用维持量的成年II型糖尿病病人，空腹血糖≥7.8mmol/L（140mg/dl）或餐后2h血糖≥11.1mmol/L（200mg/dl）；也可选择7.8mmol/L≥空腹血糖≥6.7mmol/L（120mg/dl）或11.1mmol/L≥餐后2h血糖≥7.8mmol/L的高血糖人群。

2.3.2排除标准

2.3.2.1I型糖尿病病人。

2.3.2.2年龄在18岁以下或65岁以上，妊娠或哺乳期妇女，对受试样品过敏者。

2.3.2.3有心、肝、肾等主要脏器并发症，或全并有其它严重疾病，精神病患者，服用糖皮质激素或其它影响血糖药物者。

2.3.2.4不合作者（指不能配合饮食控制而影响观察结果者）。

2.3.2.5近3个月内有糖尿病酮症、酸中毒以及感染者。

2.3.2.6凡不符合纳入标准，未按规定服用受试样品，或资料不全影响观察结果者。

2.4受试者分组

按受试者的血糖水平随机分为