大肠杆菌中非抗生素选择系统.ppt

大肠杆菌中非抗生素选择系统;背景;以非抗生素为选择压力的质粒解离后致死系统(PSK,post-segregationalkillingsystem)是解决质粒分离不稳定性的有效方法之一,即该系统并不直接参与质粒DNA的复制,而是在质粒发生不稳定分离后,杀死无质粒的子代细胞,从而在细胞传代中保持质粒稳定的性状。来源于大肠埃希菌质粒R1的hok/sok质粒PSK系统,编码一种毒素蛋白的mRNA(hokmRNA),以及一段可以阻止该mRNA表达的反义RNA(sokRNA)。其作用机理基于“毒剂与解毒剂”的原则,即在含质粒细胞中,sokRNA能够迅速与hokmRNA结合,从而抑制了hokmRNA的表达;

必要基因互补：1、dapD,在无抗生素选择下最普遍的方法，是在一个同等重要基因的缺陷或抑制表达菌株中使用一个表达载体通过重要基因的互补来实现筛选的。2、氨基酸营养缺陷。3、突变基因A和RNA/RNA之间相互作用。4、基于非抗生素选择系统的RNA。

使用一个内源性重要基因作为标志质粒选择系统，必要基因互补的一个潜在缺陷是缺陷工程菌株的制备和特异性媒介的使用。最近提出的;thefabl-triclosanmodelsystem就是基于在产物化学抑制的情况下一个必要管家基因的过量表达。

抑制剂/解毒剂选择系统，即不使用抗生素的蛋白质和DNA生产的Separate-component-stabilizationsystem。机制ccdB基因（抑制剂）和ccdA基因（解毒剂）

质粒稳定性，在生物制药的重组表达质粒中稳定考虑的是，可以通过插入基因元件来实现，例如cer基因座位。

假说：在大肠杆菌中通过重组获得的具有功能性的ccdA基因、增加稳定性的cer基因和消除抗性基因的质粒选择系统能够在选择压下能够生存并提高产物产量。

;研究目标;在无卡那选择下摇瓶培养幽门螺杆菌脲酶基因蛋白表达情况;二、在生产条件下对抑制剂和解毒剂的评估

非抗生素选择系统在发酵过程中的评估（rEPA基因表达）;三、cer基因可能的作用

为了评估在观测到的表达水平增加的情形下cer基因的真实作用，一系列新的可能表达重组AlpA蛋白的载体比如pMHp3.1(cer-,KanR+,ccdA-),pSP3(cer-,KanR-,ccdA+)andpSP5(cer+,KanR-,ccdA+)被重组合成并完成测试。在SDS使用密度定量（GeneTools软件）进行总蛋白的效益对比的并列实验清晰的显示：antibio-free+cerantibio-free-cerstandard-cer

;;四、抗生素抗性基因的消除

抗生素的选择,因此,一个抗生素耐药基因在载体中存在直到最后一步的表达要保障细胞缺乏外部污染物那就不是counter-selected毒药/解毒剂的系统

抗生素抗性标记的消除可以通过在单一酶切位点进行限制性酶切随后载体自身在连接酶作用下连接。

唯一的问题是删除片段和亲代载体之间的辨别不，不准确，还将可能涉及耗时的分析技术，如限制图谱分析技术等。为克服这个问题涉及了一个模型：;;;方法与步骤;2、幽门螺杆菌X47-2菌株作为AlpA的基因来源，用NcoI和XhoI酶切并用相同酶处理PM1800，连接后即得到pM-Hp3.1;3、为表达来自绿脓杆菌的重组胞外蛋白A（rERA）,pVC45D质粒HindIII和EcoRI位点段包含rERA基因与OmpA信号序列融合片段，为避免PCR步骤，用XbaI和EcoRI进行双酶切是包含有RBS序列和OmpA-rEPA片段独立出来，纯化后用相同的酶酶切并与PM1800连接即得到PM1816质粒。psp1以PM1816为母体包含功能性的ccdA基因，和cer基因以及完全缩短的卡那抗性基因。

;含有ccdA基因的载体psp301,psp1,psp2及其衍生物

4、psp301包含卡那霉素抗性基因和ccdA基因的5`和3`端（无功能活性）。pSP301质粒在PacI和AscI双酶切作用下，去除掉cer片段，粘性末端用绿豆核酸外切酶酶切，质粒再自身连接即得到psp2.

5、从pM1816质粒上酶切得到的XbaI-EcoRI片段包含有RBS序列和OmpA-rEPA片段用同样的限制性内切酶克隆进入psp2和psp301中，这些新的质粒的卡那抗性基因通过重组得到消除从而分别得到psp4和psp6质粒。（为获得功能性的ccdA而进行同源重组过程）;;AlpA片段采用上述同种方法，从pM-Hp3.1酶切下来的XbaI-XhoI片段包含完整的AlpA基因，相同酶进行酶切pSP2和pSP301，则卡那抗性基因被消除而产生新的质粒（pSP2+AlpA;pS