第十三章基因治疗的原理与研究.ppt

第十三章基因治疗的原理与研究进展基因治疗分类体细胞( somatic cell) 基因治疗生殖细胞( germline) 基因治疗只限于某一体细胞的基因的改变只限于某个体的当代对缺陷的生殖细胞进行矫正当代及子代 一、基因治疗的策略基因治疗的两种途径Retrovirus 逆转录病毒介导的基因转移系统——由两部分组成：Retroviral packaging system AAV 的特点●以潜伏感染为主；●病毒基因组与细胞共存；●只要宿主细胞正常，AAV 基因表达就处于抑制而维持潜伏状态；●若细胞受刺激，表达应激基因，AAV 基因表达从而使AAV 病毒复制；●产生子代病毒并释放，又感染新的细胞，建立新的潜伏状态。基因干预的种类：1. 反义RNA (antisense RNA) 2. 干扰RNA (RNA interference) 3. 核酶(ribozyme) 四环素抗性操纵子系统原理四环素抗性基因的转录受Tet 阻遏蛋白的负调控。无四环素存在时，阻遏蛋白与四环素抗性操纵子序列结合阻断四环素抗性基因的表达；四环素存在时，阻遏蛋白与四环素具有极高的亲和性，造成阻遏蛋白对四环素抗性操纵子阻遏解除，使四环素抗性基因的转录得以进行。。基因治疗的问题与展望治疗基因调控元件的选择；安全高效载体的构建和转移技术的选择；靶细胞的选择。（一）基因内部的调节机制使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件1. 使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件例如，酪氨酸酶是皮肤细胞和黑色素瘤细胞产生色素途径中的一种酶，可利用其启动子驱动治疗基因只在黑色素瘤细胞中表达，而不在正常的周边细胞中表达。不同类型的正常细胞或组织中往往存在某些特有的蛋白质，它们的基因表达调控元件可用于驱动治疗基因的特异性表达，从而起到治疗作用。前列腺特异性抗原( PSA) 是参与精液凝块中蛋白质降解、使精液液化的一种丝氨酸蛋白酶。它主要在前列腺中产生，而在前列腺癌细胞中含量很高，可以利用PSA 基因调控元件驱动治疗基因在PSA 阳性的前列腺癌细胞中表达而发挥作用，而其在PSA 阴性细胞和非前列腺癌细胞中不能使治疗基因表达。2. 使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件某些病变的细胞或组织产生一些特殊的蛋白质，其基因表达调节元件也可以用来控制治疗基因的特异性表达。甲胎蛋白( AFP) 基因正常情况下只在胚胎肝细胞中表达，不在成年肝脏细胞中表达。肝细胞腺癌细胞中AFP 基因异常激活，因此可利用该基因启动子驱动治疗基因(如自杀基因) 在癌细胞中表达，使癌细胞经给药后被杀死。癌胚抗原( CEA) 是膜糖蛋白家族的成员，在许多腺癌细胞中表达很高，采用其启动子可以使治疗基因只在CEA 阳性的癌细胞中表达，而不会在阴性细胞中表达。（二）基因外部的调节机制除利用基因内部的调节机制以外，还可通过施加外部刺激，促进治疗基因在特定细胞或组织中表达。采用热休克蛋白基因的表达调控元件来启动治疗基因，可以通过对病灶局部进行热处理，达到使治疗基因特异性表达的目的。Egr-1 基因是一种编码锌指转录因子的早期基因，包括电离辐射和细胞因子等在内的多种外部刺激都可以诱导其表达，将其调控序列启动的治疗基因(如肿瘤坏死因子基因)导入肿瘤组织，可在电离辐射等作用下，使治疗基因获得暂时性的局部表达，杀死肿瘤细胞。组织纤溶酶原激活物( t-PA) 作为溶解血栓的药剂，在中风和心肌梗死等疾病治疗中起着重要的作用。t-PA 的活性在辐射后增加50倍，表明其基因表达调控元件中存在受辐射诱导的调控元件，故可利用其调控元件启动治疗基因的表达，增强放疗效果。（三）利用病灶微环境使治疗基因特异性表达病灶微环境与正常时往往不同，因此可利用这些变化控制治疗基因的表达。例如，在肿瘤病灶处，常常出现葡萄糖缺乏等情况，葡萄糖调节蛋白GRP78/Bip 的含量也随之增加，使癌细胞能够抵御应激。当采用这种基因的启动子来控制治疗基因时，可以使治疗基因在肿瘤细胞中表达，使肿瘤组织坏死。肿瘤细胞生长速度快于形成血管的内皮细胞，造成供血不足，因此在肿瘤内部形成酸性、缺氧和营养缺乏的区域。缺氧条件可以通过缺氧诱导因子( HIF-1) 和缺氧响应元件( HRE) 相互作用，调节一些基因的表达；如果采用缺氧响应元件( HRE) 来控制治疗基因的表达，即可实现治疗基因只在缺氧的肿瘤组织中表达，而在正常组织中不表达。机体发炎时所可产生的许多急性期蛋白，其基因的启动子可以控制发炎条件下治疗基因的表达；而一旦炎症消失，治疗基因的表达也随之终止。（四）治疗基因的诱导表达采用组织特异性启动子控制治疗基因的表达，可能造成这些基因在靶细胞中表达，不再受外界控制。为了避免这种情况发生，研究人员正在开发和完善一些可诱导性基因表达系统。这种系统的