4.基因工程工具酶和载体.ppt

DNA聚合酶DNA的半保留复制 1、概念： DNA复制时每个子代DNA分子的一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种复制方式称半保留复制。 DNA聚合反应和聚合酶 1）? 聚合反应 n1d ATP DNA聚合酶 DNA + n2dGTP ==========2DNA+2(n1+ n2)PPi 模板 n2dCTP Mg2+ ↓ n1dTTP 水解 DNA聚合酶 原核细胞 DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 真核细胞 DNA聚合酶α、β、γ、δ DNA聚合酶的反应特点： 1）? 底物: dNTP 2）? 模板指导 3）? 引物 3，—OH存在 4）? 新链（DNA链）的生长方向: 5，→3， 产物DNA的性状与模板相同 发现 1970年,Temin、Mizufani、Baltimore分别从致癌RNA病毒中发现。 1964年， Temin提出前病毒学说： 单链RNA病毒 →→→ 双链DNA病毒 → 宿主细胞 　　　　　　　　　（前病毒） →恶性转化 逆转录病毒的生活周期 2、性质： 致癌RNA病毒反转录酶，一个α亚基，一个β亚基含Zn2+ 反应特点： 1） 要求引物，与模板互补，具有游离3，—OH 反转录酶发现的意义 1、 对中心法则的补充和修正； 2、 逆转录酶：RNA →cDNA， 3、?导致了“癌基因” 发现，并使致癌的分子机制研究有了重大进展。 载体（vector） 质粒（plasmid） 噬菌体（phage） 病毒（virus） 载体的条件 ? 分子小（? 10 Kb） ? 有限制酶酶切位点 ? 可自主复制 ? 有足够的copy数 ? 带筛选的标志 载体种类 克隆载体 表达载体 原核表达载体 真核表达载体 克隆载体 外源基因不表达 早期使用的克隆载体的典型代表 pBR322，目前已较少使用，多被用作构建新克隆载体的起始材料 pUC 由pBR322的氨苄青霉素抗性基因和复制子与大肠杆菌?-半乳糖苷酶?（lacZ?）基因融合而成 Cloning vectors 表达载体 含有强启动子的载体 外源基因可在启动子的控制下转录成mRNA，并最终以蛋白质的形式在宿主细胞中表达 原核表达载体：有两类 可直接表达不含任何原核序列的外源蛋白（原核表达载体） 以融合蛋白的形式进行表达（原核基因融合表达载体） 表达载体 真核表达载体含有： 原核基因序列 真核转录单位 真核表达载体：有两类 不带病毒复制子 带病毒复制子 质粒（plasmid） ? 存在于细菌等细胞质中? 双链环状DNA分子? 大约 1-200 Kb? 具有自主复制和转录能力? 不能独立存活? 在子细胞中保持恒定的拷贝数 并表达其遗传信息 Plasmid Vector a replicator(复制起点) ColE1, pMB1 copy-number pBK-CMV 2 噬菌体的生命周期 t=0 噬菌体吸附到寄主菌的细胞壁，大约在吸附的2秒钟内就会发生噬菌体DNA的注入； t=1 寄主DNA、RNA和蛋白质的合成反应被全部关闭； t=2 第一个噬菌体mRNA开始合成； t=3 细菌DNA开始降解； t=5 噬菌体DNA合成开始启动； t=9 “晚期”噬菌体mRNA开始合成； t=12 出现完整的头部和尾部结构； t=15 出现头一个完整的噬菌体颗粒； t=22 细菌发生溶菌作用，释放出约300个左右的噬菌体时粒 （2）温和噬菌体 cosmid克隆载体 cosmid（cos site-carrying plasmid） 人工构建的含有λDNA的cos位点序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。 柯斯克隆（cosmid cloning） 理论依据是： 1）在线性噬菌体DNA分子的每一端，都具有一段彼此互补的单链突出序列（cos位点)。 2）在λ噬菌体的正常生命周期中，会产生出由数百个λDNA拷贝组成的多连体分子。在此种分子中，前后两个λDNA基因组之间都是通过cos位点连接起来的。 3）λ噬菌体具有的一种位点特异的切割体系(site-specific cutting system),又叫Ter体系，能识别两个相距适宜的cos位点(38-45kb)，将多连体分子切割成λ单位长度的片段，并将它们包装到λ噬菌体头部中去。 柯斯质粒载体的特