《中药制剂分析》高效液相色谱法.ppt

高效液相色谱法 主讲人 林於 第五节 高效液相色谱法 （High Performance Liquid Chromatography HPLC） 一、概述 1.高效液相色谱法（ HPLC）系采用高压流动相，高效固定相和高灵敏度检测器的现代液相色谱法。 2.HPLC的特点 十八烷基及其他化学键合硅胶结构示意图 二、色谱仪及其工作原理 六通阀进样原理图 2.自动进样（视频） UVD光路示意图 （八）色谱仪工作原理(flash) （九）操作注意事项 1.流动相需用微孔滤膜（0.45μm）滤过并脱气才可使用。 2.开泵后，先打开冲洗键（PURGE）进行泵排气。然后将流动相接入色谱柱充分冲洗平衡，待基线稳定后方可进样。 3.测试溶液需用微孔滤膜（0.45μm）滤过。 4.使用键合硅胶柱，流动相的pH值应控制在2～8，否则色谱柱很容易损坏。 5.由于C18链在水相环境中不易保持伸展状态，故对于使用C18柱的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5％。否则C18链的随机卷曲将导致组分保留值的改变，造成色谱系统的不稳定。 6.工作完毕，应先后用水和甲醇充分冲洗液路系统，尤其是使用了含盐的流动相，更应充分冲洗。 （一）测试溶液的制备 按各品种项下的规定，制备对照品溶液和供试品溶液。操作应严格规范，定量操作（取样、提取、纯化、转移和稀释等），避免“跑、冒、滴、漏”。 （二）系统适应性试验 ▲采用药品标准规定的对照品和条件对色谱系统进行试验考查，包括理论板数、分离度、重复性和拖尾因子等四项指标。其中分离度和重复性更具实用意义。 ▲用于药品检验的色谱系统，应符合药典对系统适应性试验的规定。否则应对色谱条件作出适当的调整，使其达到有关规定。 ▲各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余的如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变, 以达到系统适用性试验的规定。 1.色谱柱的理论板数（n） n值越大柱效越高 2.分离度（R） R值越大分离效果越好 在规定的条件下，注入对照液或供试液，记录色谱图，按下式计算待测峰（定量峰）与相邻峰的分离度。除另有规定外，应大于1.5。 3.重复性 考察测量的精密度 在规定条件下，取一定量的对照液，连续进样3～5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差（RSD）应不大于2.0％。 RSD计算公式 4.拖尾因子（T） 考察色谱峰的对称性 T 值越接近于1.0 色谱峰的对称性越好，测量的准确度越高。采用峰高法测量时，应检查待测峰的T是否符合规定。除另有规定外，T应在0.95～1.05之间。 （三）上机测定 按规定分别精密吸取一定量的对照液和供试液，注入色谱仪测定，记录色谱图和有关数据。 （四）数据处理和结果判断 （1）利用保留时间（tR）进行定性鉴别 （2）利用峰高或峰面积（A）进行含量测定 （3）利用特征峰的相对保留时间和峰面积比值等参数对药品进行指纹图谱鉴定 四、HPLC在药品检验中应用 （一）定性鉴别 （保留时间比较法） 1.原理 在同一色谱条件下，相同的成分具有相同的色谱 性质和色谱行为，其色谱峰也就具有相同的保留时间。因此比较供试品色谱图和对照品色谱图，若前者中某一色谱峰的保留时间与后者色谱峰保留时间相同时，即可判定供试品中存在某种成分或某种药味。所谓保留时间相同是指基本相同, 彼此相差百分之几秒是允许的。 2.实例 百令胶囊的鉴别 本品为发酵虫草菌粉（CS-C-Q80）制成的胶囊。中国药典收载了TLC鉴别法和HPLC鉴别法等，在此仅介绍核苷类成分的HPLC鉴别法。该法采用了先进的梯度洗脱法，并以腺苷等多个组分为指标进行鉴别。 （1）色谱条件： C18柱，检测波长为260nm，理论板数按腺苷峰计算应不低于3000，以乙睛为流动相 A，以0.04mol/L磷酸二氢钾为流动相 B，按下表进行梯度洗脱： （2）腺苷对照液制备 取腺苷对照品适量，加0.5％磷