博士答辩幻灯(..机制研究).pptVIP

*****机制研究 研究生：** 导 师：*** 教授 导师组：*** 教授等 缺血性脑血管疾病是引起人类死亡和长期瘫痪的主要原因之一，目前其发病率逐年上升，给社会经济带来了极大的负担。 近年来，美国将银杏叶用作保健食品，欧洲一些国家将其作为植物药，广泛用于防治心脑血管疾病、记忆力下降及痴呆。 我国的银杏资源居世界首位，应加大力度开发，造福人民。 实验总体设计 离体 NOS、[Ca2+]i PGI2、TXA2 iv. 兔 EGB 整体 EGB 银杏叶提取物对兔脑血流量的影响 实验方法 健康新西兰兔，雌性4只，雄性4只 体重2.6±0.2kg 静脉注射3% 戊巴比妥钠溶液（30 mg/kg）麻醉 气管插管术 、单侧股动脉和股静脉插管 分离一侧颈内、外动脉，结扎颈外动脉，在颈内动脉上套电磁流量机探头 待呼吸、血压稳定后，给0.1ml/kg生理盐水，测量兔脑血流量、收缩压、舒张压，作为对照 静脉注射EGB 2.5、5.0、10.0 mg/kg，在给药后1，3，5，10，15，20，30min记录上述指标 实验结果 *p<0.05，**p<0.01 vs administration before 实验结果 实验结果 结论 静注EGB注射液能明显增加兔脑血流量，其剂量为10.0mg/kg时对兔脑血流量增加作用大于剂量为2.5、5.0mg/kg时的作用。 在给药1～5min内收缩压、舒张压略微升高，5～20min收缩压、舒张压略微下降，以后逐渐恢复正常。变化无统计学意义。 以小鼠大脑皮层血管内皮细胞研究EGB舒张血管机制 实验方法 NOS测定方法 L-Arg+O2 NO+亲核性物质 有色化合物 530nm波长下测定吸光度。 根据吸光度大小可计算出NOS活力。 培养的细胞以 1×106个细胞·L-1密度种植于 6孔板中，24h后换液，后每3d半量换液。至d6分别加入EGB 0、25、50、100、200mg·L-1。37℃培养 8h，将细胞消化，制成10％的细胞悬液，进行测定。 NOS 6-酮-前列腺素F1a和血栓素B2含量测定方法 培养的细胞以1×106个细胞·L-1密度种植于6孔板中，24h后换液，后每3d半量换液。至d6分别加入EGB 0、25、50、100、200mg·L-1及阳性对照药阿司匹林 1g·L-1。 37℃培养8h，取上清，用放射性荧光免疫法进行测定。 细胞内钙离子含量测定方法 1）培养的bEnd3细胞以 1×109个细胞·L-1密度种植于6孔板中，24h后换液，并加入EGB 0、25、50、100、200mg·L-1。 2）37 ℃培养24 h，用0.25 ％胰蛋白酶消化液消化细胞，用HEPES-Hank’s液（不含Mg2+）重悬，调整细胞浓度为 2×109 个细胞·L-1，制成细胞悬液。 3）用台酚蓝染色检查细胞的存活率，要求存活率不低于95％者进入下一步实验。 4）将制备好的细胞悬液37℃预温5min，加入Fura2-AM，使其终浓度为5umol·L-1,混匀，放入CO2培养箱中，37℃避光孵育45min，之后以1000r·min-1离心5min,弃上清。沉淀细胞用含0.2％牛血清白蛋白的HEPES-Hank’s液（不含Mg2+）洗2次，最后用HEPES-Hank’s液（不含Mg2+）调整细胞悬液为2×109个细胞·L-1。避光放置，用荧光分光光度计30min内测完。 实验结果 *P<0.01 vs control group; **P<0.05, ***P<0.01 vs previous groups 实验结果 *P<0.01 vs control groups; **P<0.05, ***P<0.01 vs previous groups 实验结果 实验结果 **P<0.01, *P<0.05 vs control groups 讨论 与血管舒张反应最为密切的物质是NO。 EGB能显著上调NOS的活性，说明其舒张血管作用部分与上调NOS的活性有关。 讨论 本实验研究所用细胞为小鼠大脑皮层血管内皮细胞，其一氧化氮合酶为内皮型（eNOS），eNOS的激活需要Ca2+及CaM的参与。 EGB能显著升高[Ca2+]i，提示其上调NOS活性可能与其升高[Ca2+]i相关。 讨论 EGB 对6-Keto-PGF1a和TXB2的水平均有一定影响（分别导致它们轻微升高和下降）。 这些结果提示EGB扩血管作用机制还包括其对PGI2和TXA2的作用，即增加PGI2水平和降低TXA2水平。 结论 EG