免疫酶组织化学技术.ppt

二、双PAP法： 原理：在PAP的基础上再重复 第二抗体和PAP复合物 抗原---特异性抗体---第二抗体（桥抗体）---PAP ---第二抗体--- PAP复合物 组织抗原 第一抗原 第二抗体 PAP复合物 双PAP法 HRP 双PAP法 组织抗原 第一抗原 第二抗体 PAP复合物 HRP 步骤：五步法 特点：敏感性较高 缺点：但步骤多，费时，非特 异背景重 三、APAAP法 原理：抗原---特异抗体---第二 抗体--- APAAP复合物 步骤：三步法 APAAP法 特点：非特异背景较轻，不受内 源性酶的干扰。 但产物易溶于有机溶剂 第五节 卵白素---生物素Avidin为一种硷性糖蛋白，由四个相同亚基组成 Biotin小分子维生素 Avidin和Biotin具有较高亲和力 一 、ABC法 Avidin Biotin Complex 原理：酶标记Biotin形成酶素化 Biotin 酶素化Biotin＋Avidin --- ABC 复合物 抗原---特异抗体--- Biotin标记 第二抗--- Avidin ● Biotin ● HRP 组织抗原 第一抗体 第二抗体 HRP 生物素 卵白素 ABC法 步骤：三步法 特点：敏感性较高，特异性强， 应用范围广 ● 某些脏器存在内源性生物素 干扰 ● Avidin与核酸及细胞膜中磷脂 有非特异反应 SABC法 Streptavidin biotin Peroxidase Complex SABC法已代替ABC法 二、LSAB法 Labelled Streptavidin Biotin Method 原理： ● Biotin标记第二抗体 LSAB法 * 免疫酶组织化学技术 第一节 基 本 原 理 抗原＋抗体（特异性）＋酶标记抗体，通过酶与底物作用生成有色反应物，定位组织或细胞内抗原的一门技术。 免疫酶组化 免疫学 (抗原抗体反应) 酶细胞化学 (底物显色反应) + 特异性 敏感性 定位性 可视性 PAP法 免疫酶组织化学基本组成： 抗原 ↓ 抗体 ↓ 放大系统 ↓ 显色系统 ABC法 免疫酶特点： 信号定位准确 标本可长期保存 阳性标记与病变关系 方法简便，易推广 一、酶及其特点 酶选择标准： ★ 该酶用细胞化学易于被检出，能被光镜或电镜观察。 ★ 酶反应产物须稳定，不扩散，具有良好定位。 第二节 酶 和 底 物 ?★ 酶易于纯化，获得纯制品。 ★ 酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。 ★ 酶在PH中性液内较稳定。 ★ 组织中不应存在与底物作用的内源性酶。 符合上述条件： 辣根过氧化物酶 碱性磷酸酶 葡萄糖氧化酶 （一）辣根过氧化物酶（HRP） ★ 分子量（40000），不会遮盖抗原的结合部位 ★ 稳定，易获得较高纯度酶 ★ 具有较高活性及特异性 ★ 可溶性佳，生成的产物不扩散 ★ 组织中内源性酶较少 ★ 可作用于多种底物，产生不同颜色 ★ HRP穿透力强，易进入细胞内 （二）碱性磷酸酶（AKP） 从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取 ● 组织穿透能力较弱 ● 内源性AKP较高 ● 左旋咪唑具有抑制作用 （三）葡萄糖氧化酶（GOD） 底物为葡萄糖，终产物稳定 ● 体内无内源性GOD ● 分子量大，穿透力较弱 二、底物及其特点 酶＋底物→酶·底物→酶＋产物（显色） HRP的底物： HRP的底物为低浓度的H2O2，供氢体为胺类及酚类化合物。 HRP显色反应： HRP＋H2O2 HRP＋H2O＋电子供体（氧化型） 电子供体 电子供体被氧化后，迅速改变颜色，通过聚合等反应，生成不溶性有色颗粒，并就地原位沉淀。 HRP常用的电子供体： ● 3.3-二氨基联苯胺(DAB)～棕色 ● 氨乙基卡巴唑(AEC)～红色，易溶于有机溶剂，易扩散，用水溶性封固剂。 ● 4-氯-1-茶酚（4CN）～蓝色，易弥散，不能久保存 ● 3.3，5.5-四甲基联苯胺(T