DNA测序技术的发展历史与最新.ppt

在2002年4月，美国《科学》杂志 ，登载了一篇长达14页的论文尤其引人注目———《水稻（籼稻）基因组的工作框架序列图》。 2004年12月，水稻基因组“精细图”全部完成 2004年12月10日，中国科学家在世界上率先完成的家蚕基因组“框架图”及基因组生物学分析成果在世界科学类权威的学术期刊——《Science》杂志上发表。 2009年12月13日，Nature杂志刊登了由深圳华大基因研究院领衔完成的大熊猫基因测序。 DNA测序技术的发展历史与最新进展 主讲人：金瑞营 第一代DNA测序技术 成熟的DNA测序技术始于20世纪70年代中期。 ●1977年Maxam 和Gilbert报道了通过化学降解测定DNA序列的方法。 ●同一时期, Sanger发明了双脱氧链终止法 ● 20世纪90年代初出现的荧光自动测序技术将DNA测序带入自动化测序的时代。 这些技术统称为第一代DNA测序技术。 化学降解法 在该方法中,一个末端被放射性标记的DNA片段在5组互相独立的化学反应中分别被部分降解,其中每一组反应特异地针对某种碱基。因此生成5组放射性标记的分子,每组混合物中均含有长短不一的DNA分子,其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA片段上的位置。最后,各组混合物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,再通过放射自显影来检测末端标记的分子。 双脱氧链终止法 原理：核酸模板在DNA聚合酶、引物、4种单脱氧核苷三磷酸( dNTP,其中的一种用放射性P32标记)存在条件下复制时,在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸( ddNTP) ,因为双脱氧核苷没有3′ -OH,所以只要双脱氧核苷掺入链的末端,该链就停止延长,若链端掺入单脱氧核苷,链就可以继续延长。如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3′端的一系列长度不等的核酸片段。反应终止后,分4个泳道进行凝胶电泳,分离长短不一的核酸片段,长度相邻的片段相差一个碱基。经过放射自显影后,根据片段3′端的双脱氧核苷,便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。 荧光自动测序技术 荧光自动测序技术基于Sanger原理,用荧光标记代替同位素标记,并用成像系统自动检测,从而大大提高了DNA测序的速度和准确性。 第二代DNA测序技术 罗氏454 公司的GS FLX测序平台 454测序技术具体步骤 文库准备：将基因组DNA 打碎成300 -800 bp长的片段(若是snRNA或PCR产物可以直接进入下一步) ,在单链DNA的3′端和5′ 端分别连上不同的接头。 连接：带有接头的单链DNA 被固定在DNA 捕获磁珠上。每一个磁珠携带一个单链DNA片段。随后扩增试剂将磁珠乳化,形成油包水的混合物,这样就形成了许多只包含一个磁珠和一个独特片段的微反应器。 扩增：每个独特的片段在自己的微反应器里进行独立的扩增(乳液PCR, emulsion PCR) ,从而排除了其它序列的竞争。整个DNA 片段文库的扩增平行进行。对于每一个片段而言,扩增产生几百万个相同的拷贝。乳液PCR终止后,扩增的片段仍然结合在磁珠上。 测序：携带DNA 的捕获磁珠被放入PTP板中进行测序。PTP孔的直径(29μm)只能容纳一个磁珠(20μm) 。放置在4个单独的试剂瓶里的4种碱基,依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板,每次只进入一个碱基。如果发生碱基配对,就会释放一个焦磷酸。这个焦磷酸在ATP 硫酸化酶和荧光素酶的作用下,释放出光信号,并实时地被仪器配置的高灵敏度CCD捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对,就会捕获到一分子的光信号;由此一一对应,就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。 454测序技术的特点 ①速度快 一个测序反应耗时10 h，获得4 － 6 亿个碱基对。比传统的Sanger 测序的方法快100 倍; ②读长长 单条序列的读长平均可达到450 bp; ③通量高 每个反应可以得到超过100万个序列读长; ④准确度高 读长超过400 bp 时，单一读长的准确性可以超过99% ; ⑤可以进行Pair-End 测序研究。 454测序仪技术应用简介 Solexa测序技术的原理 基本原理是将基因组DNA打碎成约100 - 200个碱基的小片段,在片段的两个末端加上接头( adap ter) 。将DNA片段变成单链后通过接头与芯片表面的引物碱基互补而使一端被固定在芯片上。另外一端随机和附近的另外一个引物互补,也被固定住,形成桥状结构。通过30轮扩增反应,每个单分子被扩增大约1 000倍,成为单克隆的DNA簇,随后将DNA簇线性化。 在下一步合成反应中,加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP。在DNA合成时,每一个核苷酸加到引物末端时都会释放出焦磷酸盐,激发生物发光蛋白发出荧光。用激光扫