细菌内毒素检查的基础理论.ppt

Http:// Http:// 细菌内毒素检查的基础理论 湛江安度斯生物有限公司 2009年3月 1、细菌内毒素 2、鲎试剂 3、细菌内毒素检查用水 4、细菌内毒素检查的程序 5、2005年版细菌内毒素检查法 6、相关参数的计算 7、试验相关知识 * Http:// Page * * Http:// Page * 1、细菌内毒素 化学成分及特性 是革兰氏阴性细菌细胞壁的产物 是高分子量脂多糖（LPS）的复合物 单体分子量介于10，000至20，000道尔顿 典型地以100，000至500，000道尔顿的聚合体形式存在 * Http:// Page * 特性 致热性 耐热性 酸碱性 鲎反应性 分子极性 需要在250摄氏度干热30分钟才能彻底灭活 多糖链端有亲水性，脂肪链端具有疏水性，在水中呈不均匀分布 内毒素作用于人体细胞，使之释放内原性热原刺激下丘脑体温调节中枢，使人体发热升温 能与鲎试剂发生多级酶促反应，形成凝胶 与强酸强碱水解反应，可灭活内毒素 除上述性质外，LPS还有许多其它的生物活性 * Http:// Page * 化学结构 含有3个截然不同的区域 O-特异侧链 核心多糖 类脂A * Http:// Page * 细菌内毒素与热原的关系 细菌内毒素是热原之一种 医药工业接受的观点是,内毒素是目前医药工业中最普遍和最主要的外源性热原,在GMP条件下控制内毒素污染就等于控制热原污染。 * Http:// Page * 标准内毒素与环境内毒素 标准内毒素 经人工精制并经生物效价测定的细菌内毒素,作为BET的参考标准品或对照品 标准内毒素分内毒素标准参考品(RSE)和内毒素工作标准品(CSE)两种 CSE的效价必须用RSE来标化。目前CSE的效价有两种标示方法：固定效价法（中国）及浮动效价法（国际） 环境内毒素 环境内毒素是天然的内毒素普遍存在于水、空气及各种原料中,成份除了脂多糖外还含有蛋白质、多糖和其它杂质,其两极活性不明显,致热性较弱。BET的对象是环境内毒素。 * Http:// Page * 标准内毒素溶液的制备 中国药典2005年版BET法要求,将细菌内毒素国家标准品用BET用水溶解后,需在旋涡混合器上混匀15分钟,以后每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀30秒钟,其他国家的BET法也有类似的要求。 具有两极活性的内毒素分子在水中呈现不均匀分布 * Http:// Page * 2、鲎试剂 鲎试剂的分类 根据鲎的种类分类： 美洲鲎试剂（LAL） 中国鲎试剂或东方鲎试剂（TAL） 根据检查方法分类： 凝胶法鲎试剂 光度法鲎试剂 根据鲎试剂的特异性分类： 普通鲎试剂 特异性鲎试剂 * Http:// Page * 鲎试剂的规格 一般分单次试验试剂和多次试验试剂（也称大装量试剂） 把自身的包装容器作为反应试管的试剂成为单次试验试剂，在国内使用的0.1ml/支的鲎试剂就属于单次试验试剂。国际上使用的单次试验试剂称0.2mL/支试剂，及直接加0.2mL供试液复溶试剂兼检测。 多次试验试剂有0.5ml/支、1.2ml/支等，使用时应先用相应量的溶解液复溶鲎试剂。 * Http:// Page * 鲎试剂的质量标准 灵敏度 定义：在细菌内毒素检查法规定的条件下，能使鲎试剂产生阳性的标准内毒素的最低浓度，单位为EU/ mL 常用鲎试剂的灵敏度 0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、0.06EU/ml、0.03EU/ml 自身凝集 部颁标准，鲎试剂的阴性对照在37度4小时不产生阳性反应 缓冲能力 干燥失重 * Http:// Page * 鲎试剂与内毒素的反应机理 405nm测光度值 pNA（对硝基苯胺，黄色） AC-Ile-Glu-Ala-Arg-OH AC-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA（酶作用物） 凝固酶 凝固酶原 活化B因子 B因子 活化C因子 C因子 内毒素 凝固蛋白原 凝固蛋白（凝胶） G因子 活化G因子 β葡聚糖或LAL-RM 凝胶法、比浊法 显色法 旁路反应 * Http:// Page * 3、细菌内毒素检查用水（BET水） 2000年版药典要求，BET水应为与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂在37℃±1℃条件下24小时不产生凝聚反应的灭菌注射用水。 2005年版药典要求，凝胶法BET水应为内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水；光度测定法用的BET水内毒素含量应少于0.005EU/ml。 美国药典要求的BET水是指与所使用的鲎 试剂不发生反应的灭菌注射用水或其它水。 * Http:// Page * 4、细菌内毒素检查的程序 验证实验 凝胶法 灵敏度复核试验 干扰试验 光度测定法 标准曲线可靠性试验 干扰试验 * Http