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实验六 动物骨髓细胞染色体的制备与观察 [实验目的] 1. 通过青蛙或小白鼠骨髓细胞染色体的制备，初步掌握低渗法制备动物骨髓细胞染色体的方法。 2. 熟悉染色体的形态、种类及青蛙、小白鼠等动物染色体的数目或类别。 [实验原理] 骨髓细胞是具有旺盛分裂能力的细胞，从这些分裂细胞中，可观察到处于分裂中期的染色体，能对一种动物染色体的形态特征、数目进行准确的观察和分析。由于骨髓直接涂片观察到的分裂相少，效果差，因此要对骨髓细胞进行必要的处理。这个处理方法称为低渗法，其基本要求首先是要获得较多的中期分裂相。秋水仙素对分裂期纺锤丝的形成具有破坏作用，当动物被注射适量的秋水仙素后，处于分裂增殖中的骨髓细胞由于纺锤丝不能形成，中期染色体不能正常趋向两极，到达后期、末期，因而大量的细胞处于观察染色体形态最佳的分裂中期。其次是要能够清楚的观察染色体的形态。为了达到此目的，取出的骨髓细胞要经过低渗（kcl溶液）使细胞膨胀、染色体适当的分散。固定（甲醇、冰醋酸）使染色体保持完好的形态。染色（giemsa液）使染色体易分辨、观察。利用动物骨髓制作染色体观察标本取材容易，不需培养，不需无菌操作，比较简便，是生物学实验教学中常用的方法。一般选用的动物有青蛙、蟾蜍、小白鼠、大白鼠等。 三、实验材料及用品 1、材料：青蛙或小白鼠、大白鼠、蟾蜍，雌雄均可。 2. 试剂：0.02﹪秋水仙素、0.075mol/l氯化钾 (kcl)、3:1甲醇、冰醋酸固定液、吉姆萨（giemsa）染液。 3. 器材：解剖盘、小镊子、剪刀、注射器（5ml一支）、刻度离心管、玻璃吸管、预冷载玻片、染色缸、玻片盒、量筒、恒温水浴箱，显微镜、酒精灯、火柴。 四、实验方法及步骤 各种动物骨髓细胞染色体的制备方法基本都采用低渗法，现以青蛙为例，说明其制备的过程。 1. 取健康青蛙一只，按每10g体重由腹腔注入含量为0.02% 的秋水仙素0.3ml（此步在实验前12～24小时完成，哺乳动物在实验前2～4小时完成）。 2. 将青蛙处死，迅速取出后腿长骨，包括股骨和胫骨，为了获得较多的骨髓细胞，前肢亦可使用。 3. 用剪刀、镊子剥离肌肉及结缔组织，剪去两头的骨结，迅速用5ml注射器抽取0.075mol/l的kcl溶液，从一头插入骨髓腔冲洗，冲洗液接入刻度离心管内，反复多次，直至骨髓腔变白。此时不要让组织块掉进离心管，如掉入，一定要用镊子或吸管取出。加低渗液至5ml或8ml刻度，放入37℃恒温水浴箱内低渗处理25分钟。 4. 低渗完毕，取出离心管，向离心管中加入1ml左右3﹕1甲醇、冰醋酸固定液进行预固定。1～2分钟后，每两支离心管成对放在天平上配平，使两支管的重量相等，然后将这两支管对应的放入离心机内的孔中，以1 500r/min 离心6～8分钟。 5. 取出离心管，弃去上清液，再加固定液至6～8ml，用玻璃吸管沿离心管壁吹打，使沉淀的细胞团块在固定液中充分均匀，然后放入37℃水浴箱中固定15分钟。 6. 再取出离心管，配平后离心6～8分钟，转速同样为1 500r/min。离心完毕，去掉上清液，再加入1ml左右的固定液，用吸管吹打，制成细胞悬液。 7. 取预冷湿玻片一张，用吸管吸取细胞悬液，从40～50cm左右的高度滴到载玻片上，再用口吹散滴液，置于酒精灯上微微火烤，最后放置晾干。 8. 将晾干的玻片放入吉姆萨应用液染色缸中，或将玻片平放于桌上，将染液滴在片上染色。染色15分钟后，用自来水小心冲去染液，置于酒精灯上微微火烤，最后放置晾干后镜检 。 五、实验作业 1.绘制一个图像清晰、形态典型的青蛙染色体组型图。 2、绘制本实验流程图，明确实验过程。 3、说明为什么滴片时要用冰冻的冷载玻片？ 4、说明0.075mol/KCL的作用？ 5、秋水仙素水溶液的作用？ 6、总结影响制片效果的因素。 * 剪掉 剪掉 注射器 *