膜片钳技术与离子通道药理学.ppt

1991 Nobel基金会的颁奖评语： 膜片钳技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，为细胞生理学的研究带来了一场革命性的变化，它和基因克隆技术并驾齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。 离子通道 (ion channels) 离子通道是细胞膜上的一种特殊整合蛋白，对某些离子（K+、Na+、Ca2+等）能选择通透，其功能是细胞生物电活动的基础。 离子通道的特性(Characteristic of Ion Channels) 一、离子选择性(selectivity )（大小和电荷）： 某一种离子只能通过与其相应的通道跨膜扩散(安静：K>Na 100倍、兴奋： Na>K 10-20倍）；各离子通道在不同状态下，对相应离子的通透性不同。 二、门控特性(Gating)： 失活状态不仅是通道处于关闭状态，而且只有在经过一个额外刺激使通道从失活关闭状态进入静息关闭状态后，通道才能再度接受外界刺激而激活开放。 配体门控通道 阳离子通道：乙酰胆碱、谷氨酸、五羟色胺受体 阴离子通道：甘氨酸和γ－氨基丁酸受体 电压门控通道：钾、钠、钙离子通道 Patch-clamp(膜片钳)技术 基本原理 利用负反馈电子线路,将微电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上,对通过通道的微小离子电流作动态或静态观察,从而研究其功能。 膜片钳技术的优点 膜片钳技术实现了小片膜的孤立和高阻封接的形成，由于高阻封接使背景噪声水平大大降低，相对地增宽了记录频带范围，提高了分辨率。另外,它还具有良好的机械稳定性和化学绝缘性。而小片膜的孤立使对单个离子通道进行研究成为可能。 膜片钳记录的各种模式 根据膜片与电极之间的关系，可将膜片记录主要分为４种模式 。 首先建立的单通道记录法（Single channel recording）是细胞吸附式，其后又建立了膜内面向外和膜外面向外的模式；还有一种是全细胞记录法（Ｗhole cell recording）的全细胞式。现在又发展了开放的细胞吸附式膜内面向外和穿孔囊泡膜外面向外的模式 ，以及穿孔膜片的模式。 细胞吸附膜片(cell-attached patch mode) 一种将微电极吸附在细胞膜上对单离子通道电流进行记录的模式。 优点是不破坏细胞的完整性, 内环境保持正常。缺点是不能人为直接地控制细胞内环境条件，不能确切判明细胞内电位。即使在浴液中加入刺激物质，也不能到达与电极内液接触的膜片的细胞外面。 内面向外膜片(inside-out patch) 在细胞吸附模式高阻封接形成后,将微管电极提起,使吸附的膜片从胞体上被切割下来，就得到“内面向外”膜片。此种模式，可直接且自由地经浴液介导而调控细胞内液的条件，并可在和细胞活动无关的形式下观察到单一离子通道的活动。 由于胞质渗漏，可能丢失某种通道调控因子，离子通道活动出现run-down （或run-up）现象。 外面向外膜片(outside-out patch) 在全细胞模式上将微管电极向上提起,可得到切割分离的膜片，断端游离部分自行融合成脂质双层,此时高阻封接仍然存在。而膜外侧面接触浴槽液。用这种模式，可自由改变细胞外液的情况下，记录单一离子通道的电流活动。 全细胞记录式(Ｗhole-cell recording) 在细胞吸附模式下继续以负压抽吸使电极管内细胞膜破裂,电极胞内液与胞内液直接相通,而与浴槽液绝缘。 这种形式记录膜片以外部位的全细胞膜的离子电流。它既可记录膜电位又可记录膜电流。其中膜电位可在电流钳情况下记录,或将玻管连到标准高阻微电极放大器上记录。 开放细胞吸附膜内面向外模式（open cell-attached inside-out mode） 将细胞吸附式的膜片以外的某部位的胞膜进行机械地破坏，经破坏孔调控细胞内液，并在细胞吸附状态下进行内面向外的单一离子通道记录。 这种方法的细胞体积越大，破坏部位离被吸附膜片越远或破坏孔越小，都可导致细胞因子外流变慢。 穿孔膜片模式（perforated patch mode） 为克服全细胞模式的胞质渗漏问题，Horn和Marty将与离子亲和的制霉菌素（或二性霉素Ｂ）经膜片微电极灌流到含类甾醇的细胞膜片上，形成只允许一价离子通过的孔，用此法在膜片上做很多导电性孔道借此对全细胞膜电流进行记录。因为此模式的胞质渗漏极为缓慢，局部串联阻抗较全细胞模式高，所以钳制速度很慢，故也称为缓慢全细胞模式。 穿孔囊泡膜外面向外模式(perforated vesicle outside-out mode) 穿孔膜片模式将电极向上提起，便在微电极尖端处形成