“有机污染物——苯酚的生物降解特性研究”设计方案.doc

“有机污染物——苯酚的生物降解特性研究”设计方案 实验目的 酚类化合物为原生质毒物，毒性较大。焦化、煤气、石油、木材防腐、造纸、合成氨等工业废水中都含有高浓度的苯酚。含酚废水在我国水污染控制中被列为重点解决的有害废水之一。利用降解菌来控制苯酚的污染，越来越受到人们的重视。本项目拟采用微生物培养、微生物DNA的提取、分光光度计测定、PCR、TA克隆等实验技术，阐明苯酚降解菌株生长特性和酚特性利用以苯酚为唯一碳源和能源的无机盐溶液作为驯化液对某废水处理厂活性污泥进行驯化培养从中分离筛选苯酚降解菌比浊法测定微生物生长量4-氨基安替比林直接光度法1）微生物生长量的测定方法——比浊法 比浊法是实验室中常用的用来测定微生物生长量的方法，以反映微生物数量或浓度的一种指标。该方法是根据当某一波长的光线通过混浊的液体后，强度将被减弱。入射光与透过光的强度比与样品液的浊度和液体的厚度相关。根据所测得的吸光值，就可以得到微生物的生长量。本实验采用的波长为600nm，使用空白培养基作为对照。 2苯酚浓度的测定方法16S rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的染色体基因组中。16S rRNA具有高度的保守性和特异性。随着PCR技术的出现及核酸研究技术的不断完善，16S rRNA基因检测技术已成为检测和鉴定的一种强有力工具。该技术主要有三个步骤：首先基因组DNA的获得其次16S rRNA基因片段的最后进行16S rRNA基因序列的分析。磁力搅拌器电子天平玻片苯酚，牛肉膏，蛋白胨，琼脂粉，淀粉，葡萄糖，乳糖，柠檬酸，氨水，盐酸，氢氧化钠，乙醇，氯化钠，4-氨基安替比林，铁氰化钾，氯仿，氨苄霉素菲硝基苯多氯联苯苯甲酸，邻苯二胺，NaH2PO4，NaH2PO4 K2HPO4，CaCl2，MgSO4 7H2O硫酸铵，醋酸钠结晶紫，番红，碘液，pH试纸Parafilm（2卷），琼脂粉（3瓶），琼脂糖（3瓶），蛋白酶K（2瓶），溶菌酶（2瓶），RNA酶形态特征降解菌株进行平板涂布，长出单菌落后进行观察描述菌落的形态，如菌落的颜色，湿度，粘稠度，透明程度，边缘形态等。取少量细菌进行染色，显微镜下观察，描述细菌单细胞的形态，如细菌的形状，革兰氏染色情况，有无鞭毛等。各种因素对菌株的影响分别考查苯酚浓度温度、pH 值、溶氧量（摇床转速）等环境因素对降酚菌生长和能力的影响进而确定最佳生长和。苯酚，琼脂粉，淀粉，葡萄糖，乳糖，柠檬酸，氨水，盐酸，氢氧化钠，乙醇，氯化钠，4-氨基安替比林，铁氰化钾，氯仿，水杨酸苯酯，对氨基苯磺酸，对羟基苯甲酸甲酯，对硝基苯酚，水杨酸甲酯，甲萘胺，菲硝基苯多氯联苯苯甲酸，邻苯二胺NaH2PO4，NaH2PO4，K2HPO4，CaCl2，MgSO4 7H2O硫酸铵，pH试纸等磷酸缓冲溶液pH8. 0)：NaH2PO4?2H2O 94.7g，NaH2PO4?2H2O 5.3g，溶解，定容至1L无机盐培养基：（NH4）2SO4 2 g/L，MgSO4 7H2O 0.35 g/L，CaCl2 0.1 g/L，K2HPO4 0.5 g/L，NaH2PO4 0.5 g/L，pH 7.0左右，苯酚按需要量添加；摇床、恒温培养箱、灭菌锅、电子天平、超净工作台、磁力搅拌器、分光光度计三、实验步骤 1）苯酚浓度的测定——4-氨基安替比林直接光度法准确移取20. 0mL酚标准工作溶液于200mL烧杯中加入10. 0mL 0. 5mol/L 的NH3 ?H2O稀释至100mL用磷酸缓冲溶液调节pH为8. 0将调好pH值的溶液转入500mL 的分液漏斗中加入2. 0mL 4 - 氨基安替比林混匀再加入3. 0mL K3〔Fe (CN) 6 〕溶液充分混匀后放置10min。准确加入20. 00mL三氯甲烷萃取闭塞、剧烈振摇2min静分层。将氯仿层放入1cm比色皿以试剂空白为参比测定其吸光度。 制作苯酚浓度的标准曲线将标准苯酚溶液稀释成不同浓度，按实验方法，测定吸光值，绘制标准曲线。降酚菌生长与降解特性的研究对菌株降酚能力的影响 分别取3mL菌悬液接种于100mL， 1000mg/L 的无机盐培养基中，，0 r/min下进行培养， h、48h后 取样，测定菌液的生长量和苯酚的降解率。. 苯酚浓度对菌株降酚能力的影响 分别取3mL菌悬液接种于100mL，苯酚浓度分别为500，750，1000，1 500mg/L 的无机盐培养基中，，0 r/min下进行培养， h、48h后 取样，测定菌液的生长量和苯酚的降解率。 . 各种培养因素对菌株降酚能力的影响 选取1000mg L-1）的苯酚作为研究浓度，分别考查、pH 值、溶氧量（摇床转速）等因素对降酚菌生长和降酚能力的影响，进而确定最佳生长和降酚条件。每次选定一个因素作为变量，保