农杆菌介导iaaM 基因黄瓜遗传转化体系的建立.docVIP

农杆菌介导iaaM 基因黄瓜遗传转化体系的建立 苏绍坤, 刘宏宇, 秦智伟* （（ 东北农业大学园艺学院，黑龙江哈尔滨150030） 收稿日期：2004- 03- 21 基金项目：国家高科技研究发展计划( 863) 资助项目( 2002AA2 7013) 作者简介：苏绍坤( 1978- ) , 男, 黑龙江人, 硕士研究生, 研 究方向为蔬菜分子遗传育种。 * 通讯作者E- mail: qzw303@126. com 摘要：以已经建立的高频黄瓜再生体系为基础, 从影响黄瓜转基因体系的农杆菌侵染时间, 共培养时是否 加入乙酰丁香酮等因素优化了黄瓜遗传转化体系; 将单性结实基因iaaM以农杆菌介导法导入到东农649 品种黄 瓜子叶节中, 经过不定芽诱导和生根等过程获得了转基因株系, 通过特异性引物的PCR 鉴定, 40 个株系扩增出 iaaM目的基因片段。PCR- Southern 检测为阳性。转基因阳性植株移栽到温室中, 其果实经检测80%为单性结实 黄瓜。 关键词：黄瓜; 单性结实基因iaaM; 遗传转化; 抗性鉴定 转基因技术在黄瓜上的应用一直受再生频率 和遗传转化频率低的限制, 国内外从事黄瓜体外 再生研究主要是从原生质体培养和体细胞悬浮培 养入手[1- 2], 这些方法同样难以提高遗传转化频率。 因此, 建立一个高效的再生及遗传转化体系对黄 瓜转基因研究具有十分重要的意义。黄瓜在我国 栽培广泛, 在蔬菜生产和国民经济中均占有一定 的地位。我国保护地栽培的面积正不断扩大, 目 前, 黄瓜的栽培面积仅次于番茄居第二位, 所用 的品种多为长春密刺、津春系列和津优系列等, 这些品种在其开花坐果期往往受到低温的影响或 遇到多阴连雨的天气将导致授粉受精不良、结果 率低、果实易表现畸形而导致减产和降低果实的 商品性。若进行人工授粉或饲放蜜蜂授粉, 则增 加生产成本, 降低效益, 而单性结实品种可以克 服以上缺陷。本实验将单性结实基因iaaM导入黄 瓜中, 增加子房中生长素的含量, 提高转基因植 株的单性结实率, 不仅为黄瓜的育种提供了单性 结实能力的新材料, 而且还为分子水平上的黄瓜 果实发育研究打下基础, 为甜瓜, 西瓜等其它园艺作物的单性结实研究提供参考。 1 材料与方法 1.1 植物材料及无菌苗培养 黄瓜亲本品种649 由东北农业大学园艺学院瓜 类课题组提供; 黄瓜种子在50%次氯酸钠中消毒 10 min, 在70%酒精中消毒30 s, 无菌水冲洗5~6 次, 然后接种于琼脂固体培养基。在组织培养室中 培养得无菌苗。 1.2 根癌农杆菌及其质粒 采用根癌农杆菌LBA4404 菌株, 其中含质粒 pCAM- 2A12iaaT, 该质粒带有单性结实基因iaaM 和抗卡那霉素( Km) 筛选的新霉素磷酸转移酶NptⅡ 基因, 基因表达由启动子2A12 调控。 1.3 菌株的培养 将农杆菌划线培养在含有50 mg·L- 1 卡那霉素 和50 mg·L- 1 链霉素, 50 mg·L- 1 利福平的YEB 培养 基上, 长出菌落后, 挑取单菌落接种于10 mL YEB 液体培养基中, 28 ℃振荡培养, 过夜。取5 mL 接 种于50 mL YEB 液体培养基中振荡培养, 进行2 次活化。OD600=0.5～0.6 时即可用于侵染。 1.4 影响根癌农杆菌转化效果的因素 以649 为主要试材, 取3 d 苗龄的子叶节为外 植体, 与OD600=0.5～0.6 的菌液真空侵染7 min, 在 黑暗下共培养2 d 后, 转入筛选培养基进行选择培养。其间继代2~3 次。在以下影响因子的设计处理 中, 分别以某一因子为变量, 以对应因子作对照, 其它因子以上述转化程序为标准, 观察各影响因 子对转化频率的影响。所有实验处理均设3 次重 复。 1.4.1 预培养和共培养方式 外植体在预培养培养基上预培2 d 后进行侵染 转化, 设不预培养对照; 共培养分光培和暗培两 种, 观察对转化频率的影响。 1.4.2 不同共培养基对转化频率的影响 共培养培养基pH 分别为5.2, 5.4, 5.8。 1.4.3 侵染时间和侵染方式 分别设3, 7, 15 min, 真空侵染和摇动侵染 观察对转化的影响。 1.4.4 卡那霉素筛选浓度确定 初步筛选试验: 将子叶节接种到含卡那霉素浓 度0, 25, 50, 75, 100 mg·L- 1 的芽诱导培养基上 进行培养, 10 d 继代1 次, 3 周后统计分化结果。 最终筛选浓度确定: 以初步筛选结果较好的浓 度为中心, 设置第2 次浓度梯度, 共设为5 个梯 度, 方法同上。3 周后调查结果, 以完全抑制子叶 节分化为最佳的筛选浓度。 1.5 抗性植株的分子检测 1.5.1 PCR 检测 植物总DNA 的提取用