生物化学-常用分子生物学技术的原理及其应用.ppt

酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是当猎物蛋白和诱饵蛋白特异结合后，诱饵蛋白结合于报道基因的启动子，启动报道基因在酵母细胞内的表达，如果检测到报道基因的表达产物，则说明两者之间有相互作用，反之则两者之间没有相互作用。将这种技术微量化、阵列化后则可用于大规模蛋白质之间相互作用的研究 A、制备基因敲除的胚胎干细胞（同源重组） B、制备基因敲除动物（小鼠） （三）、基因治疗的基本程序 1、治疗性基因的选择 2、基因载体的选择 3、靶细胞的选择 4、基因转移，转化 （转入受体细胞） 5、外源基因表达的筛选 利用标记基因 6、回输体内 病毒载体 非病毒载体 体细胞 间接体内疗法 直接体内疗法 筛选标志： 新霉素磷酸转移酶 ，G418（遗传霉素） *基因治疗的应用实例 1、对ADA缺乏症的治疗 （SCID，复合型重症免疫缺乏综合症）。 2、对遗传性高胆固醇血症的治疗 3、 对肿瘤的治疗 转氨基偶联嘌呤核苷酸循环 苹果酸 腺苷酸 代琥珀酸 次黄嘌呤 核苷酸 (IMP) 腺苷酸代琥 珀酸合成酶 α-酮戊 二酸 氨基酸 谷氨酸 α-酮酸 转氨酶 1 草酰乙酸 天冬氨酸 转氨酶 2 此种方式主要在肌肉组织进行。 腺苷酸 脱氨酶 H2O NH3 延胡索酸 腺嘌呤 核苷酸 (AMP) 1、遗传性单基因疾病（monogenic diseases）是基因治疗的理想侯选对象，例如腺苷脱氨酶ADA缺乏的严重联合免疫缺陷（SCID），由于淋巴细胞缺乏ADA酶，造成腺苷及dATP的堆积，可破坏免疫功能，患儿很少活至成年。若淋巴细胞ADA恢复至正常水平的5%～10%即能维持免疫系统的功能，对病人症状就有改善，这是第一个基因临床治疗的方案。 又例如有些遗传疾病是某些特殊细胞基因缺损造成的，但那些有关的细胞不易取出供体外基因工程操作用。例如Parkinson症是脑黑质细胞（substantia nigra）的酪氨酸羟化酶缺乏，不能产生多巴胺（dopamine），给病人注射多巴胺可减轻症状。动物模型试验表明，将酪胺酸羟化酶基因转导成纤维细胞，再移植至脑内，可以减轻动物模型的异常行为。。 2、对遗传性高胆固醇血症的治疗 3、对恶性肿瘤的治疗 恶性肿瘤属复杂基因疾病(complex genetic diseases)，可能涉及多种基因的异常，发病过程是多步骤的，至今虽有不少有关的基因被鉴定，但肿瘤发病的分子机制尚未清楚，因此治疗时应选择何种靶基因不明确，多数是根据不同的环节，设计不同的治疗策略，目前临床恶性肿瘤的基因治疗策略有十余种之多。 1)、免疫基因治疗(immunogene theray) 分体外转导和体内转导二种。体外转导将一些能刺激免疫反应的细胞因子基因，如 IL-2、IL-12、IFN-γ等转导肿瘤细胞作为基因工程“瘤苗”，给肿瘤患者注射，宗旨为提高肿瘤细胞的免疫原性，有利于被机体免疫系统识别及排斥；由于转导了细胞因子基因的肿瘤细胞在体内能持续不断分泌细胞因子，能增强抗肿瘤的特异免疫和非特异免疫反应，在肿瘤局部形成一种较强的抗肿瘤免疫反应微环境，并能通过局部免疫反应，引发全身的抗肿瘤免疫机能，此策略已应用于多种恶性肿瘤的临床试验。本实验室研究了IL-2基因转导的人肝癌和胃癌细胞“瘤苗”，后者已被中国药物管理局批准用于临床研究。另一种策略是将细胞因子基因或MHC I类基因直接体内注射于肿瘤局部，以促发抗肿瘤免疫反应。 免疫逃逸 2)、自杀基因系统 自杀基因（suicide gene）来源于病毒、细菌或真菌，例如单纯性疱疹病毒的胸苷激酶（thymidine kinase,TK）基因，能将一种对哺乳动物无毒害的嘌呤核苷的类似物甘苷洛韦（gancilovir, GCV）转变成三磷酸形式，后者可掺入新合成的DNA链，造成DNA链的断裂和抑制DNA聚合酶的活性，从而造成细胞死亡。所以将HSV-tk基因体内转导肿瘤细胞，然后再给患者服用GCV药物，肿瘤细胞表达TK基因能使无毒的GCV转变成有毒的三磷酸GCV，达到杀伤肿瘤细胞的目的。 3)、抑癌基因 (tumor suppressive gene) 抑癌基因p53的突变与多种肿瘤的发生有密切的关系。将野生型(正常)的p53转导 p53缺陷的恶性肿瘤，使其能表达正常的p53产物，后者具有强大的抑制肿瘤细胞生长和诱导肿瘤细胞凋亡的作用，从而达到抗肿瘤效果。 基因治疗—自杀基因被导入肿瘤靶组织 复习题 1、PCR的基本原理？PCR反应体系包括哪些组分? 常用PCR有哪些及其应用。 2、DNA测序需用哪些酶与底物？简述DNA测序的原理。 3、简述酵母双杂交原理？钓饵蛋白和猎物蛋白的作用及如何证明蛋白质之间发挥了相互作用。