激光共聚焦显微镜的应用技术.pdfVIP

现代仪器() 二○○九年·第四期 激光共聚焦显微镜的应用技术 王珺 王燕 龚 坚 唐微 （郧阳医学院基础医学研究所 十堰 442000） 摘 要 阐述L SM510 激光扫描共聚焦显微镜的工作原理及主要功能，提出L SM510 激 光扫描共聚焦显微镜的使用方法及荧光探针的选择。 关键词 共聚焦显微镜 荧光探针 使用 激光扫描共聚焦显微镜 (Laser Scanning Confo- 点光源对标本内焦平面上的每一点扫描，标本上的 cal Micr oscop e, 简称 L SCM) 与传统显微镜相比， 被照射点发射的荧光在探测针孔处成像，而来 自该 具有高分辨率、高灵敏度、高放大率等特点，在细 点以外的任何发射荧光均被探测针孔阻挡，由探测 胞水平上可做多种功能测量和分析，能得到真正具 针孔后的光电倍增管逐点接受，在计算机监视器屏 有三维清晰度的原色图像，同时激光扫描共聚焦显 幕上形成荧光图像。所以照明针孔与探测针孔相对 微镜可以处理活的标本，不会对标本造成物理化学 于物镜焦平面是共轭的，也就是说照明针孔与探测 特性的破坏。随着软件开发和应用技术的不断完善， 针孔具有共同的焦平面。在载物台上加一个微量步 激光扫描共聚焦显微镜已成为形态学、分子细胞生 进马达，使载物台沿垂直方向(Z 轴 ) 上下步进移动， 物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代 将样品新的一个层面移到焦平面上，这个层面又成 强有力的研究工具。下面以L SM510 激光扫描共 像在显示器上，随着 Z 轴的不断移动，就可得到 聚焦显微镜为例对其应用做一简单介绍。 样品不同层面连续的光学图像，实现 “光学切片” 的目的 , 被形象地称为 “显微 CT”, 在此基础上计 1 LSCM的基本组成及原理 算机系统 自动进行三维重建。 激光扫描共聚焦显微镜是一种用于图像采集和 2 基本功能 分析的精密仪器。其主要由激光光源 （氩离子激光 器 ：457nm 、477nm 、488nm 、514nm ，氦氖 绿激 (1) 多荧光探针标记样品高清晰度、高分辨率 光器 ：543nm ，氦氖红激光器 ：633nm ，半导体激 图像的采集；（2) 无损伤连续光学切片图像的采集— 光器 ：405nm ）、显微镜光学系统、扫描装置 （检 显微 “CT”；(3) 三维图像重建 ；(4) 时间序列扫描 ： 测针孔光栅、分光镜、发射荧光分色器等）、检测 XYt 、XYZt 和 Xt 扫描，通常指共聚显微镜系统 器 （高灵敏度的光电倍增管 (PMT) ，电压越高，则 沿着时间轴对活体细胞和活体组织内被标记物变化 2+ + + 光信号转换成的电信号越强，可将荧光图像的强度 的动态跟踪。如测细胞内Ca 、K 、N a 等离子浓 按照 0~255 分级显示）、计算机控制系统等组成 （见 度的变化 ；(5) 感兴趣区域的扫描 ；(6) 定位、定量 图 1）。 测定 ；(7) 图像处理。 3 荧光探针的选择 3.1 选择荧光探针的主要步骤