携带Tumstatin基因的双歧杆菌的构建及鉴定.pdfVIP

摘 要 目的：构建能在双歧杆菌内稳定、高效、分泌性表达的大肠杆菌-双歧杆菌穿梭质粒载体， 将人tumstatin基因克隆入该表达载体，筛选出携带tumstatin 的转基因双歧杆菌，并验证其表 达，探索适合抗肿瘤基因治疗的新型载体。 方法：在原核表达载体pBAD-A 的基础上，首先以双歧杆菌内源性阿拉伯糖苷酶的分泌性 信号肽(Bifidobacterium endogenous arabinosidase signal peptide sequence)序列取代载体原有 的分泌性信号肽序列，构建出质粒载体pBADs 。然后将PCR扩增得到的双歧杆菌天然质粒 聚合酶基因(Bifidobacterium plasmid polymerase,BPP)克隆入载体pBADs 中，获得双歧杆菌 的表达载体pBADs-BPP ，并观察BPP基因对质粒载体在双歧杆菌中稳定性的影响。选择增 强型绿色荧光蛋白基因（Enhanced green fluorescence protein,EGFP ）作为报告基因，构建 质粒载体pBADs-BPP-EGFP ，电转化长双歧杆菌，以0.2% L-阿拉伯糖（L-arabinose ）诱导 表达。在激光共聚焦显微镜下观察转基因双歧杆菌中EGFP 的表达，运用免疫蛋白印迹 （Western blot ）检测转基因双歧杆菌中EGFP 的表达水平。参照GenBank 中人tumstatin基因 的序列，合成人tumstatin 基因序列并克隆到穿梭质粒pBADs-BPP 中，构建出质粒载体 pBADs-BPP-Tumstatin 。电转化长双歧杆菌，筛选出阳性克隆菌株，以Western blot检测转 基因双歧杆菌中tumstatin 的蛋白表达水平。 结果：(1)BPP基因可以增加质粒载体在双歧杆菌中的稳定性。(2)含EGFP基因的转基因双 歧杆菌在激光共聚焦显微镜下观察到绿色荧光。(3)含EGFP基因的转基因双歧杆菌经 Western blot检测到分子量为27kD 的目的蛋白条带。(4)含tumstatin基因的转基因双歧杆菌经 Western blot检测到分子量为29KD 的目的蛋白条带。 结论：(1)成功地构建了双歧杆菌分泌型表达质粒载体。(2)构建的双歧杆菌分泌型表达质粒 载体可以表达报告基因EGFP 。(3)构建了能够表达人tumstatin基因的转基因双歧杆菌。 关键词：长双歧杆菌；质粒聚合酶基因；绿色荧光蛋白 (EGFP) ；tumstatin ；穿梭质粒；基 因治疗 I ABSTRACT Objective: To construct Escherichia coli-Bifidobacterium longum shuttle expression vector.Human tumstatin gene was synthesized and cloned into the vector. Screening the genetically engineered B. longum and the expression of tumstatin gene was confirmed by Western blot. The results suggest that Bifidobacterium could be used as a highly specific gene delivery vector for cancer therapy. Methods: The vector was constructed on the basis of E.coli vector pBAD-A.Firstly,the secretary signal peptide sequence of Bifidobacterium endogenous arabinosidase was cloned by PCR and introduced into the plasmid pBAD-A to take the place of the signal