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PCR 引物设计及软件使用技巧 张新宇，高燕宁* （中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所，北京100021 ） 摘 要：本文旨在介绍使用软件设计PCR 引物的技巧。在PCR 引物设计原则的基础上，详 细介绍了两种常用引物设计软件的基本使用方法，并对其各自的优缺点进行了比较。一般性 引物自动搜索可采用“Premier Primer 5 ”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo 6 ”软件。 关键词：PCR ；引物设计 中图分类号：Q524 To design PCR primers with Oligo 6 and Primer Premier 5 Zhang Xinyu, Zhu Youkang, Gao Yanning (Cancer Institute, Chinese Academy of Medical Sciences,Beijing,100021,China) Abstract: The skill of PCR primer design with software is introduced in this paper. Based on the principal of PCR-primer design, the usage of two kinds of popular primer-design software was reviewed detailedly, including their merit, demerit and usage skills. It is recommended that to use Premier Primer 5 does the usual automatic primers search, but Oligo 6 primers analysis. Key Words: PCR primer; design; usage skill; 自从1985 年Karny Mullis 发明了聚合酶链式反应以来，PCR 技术已成为分子生物学研 究中使用最多、最广泛的手段之一[1]，而引物设计是 PCR 技术中至关重要的一环。使用不 合适的PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚 体带），不出带或出带很弱，等等。 现在PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得 到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。一般来说，专门进行PCR 引物设计的专业软件功能更为强大，但使用起来却不太容易。本文将就引物设计原则及软件 使用问题进行探讨。 1. 引物设计的原则 引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避 免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即 错配)。 具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度 （primer length ），产物长度 1 （product length ），序列 Tm 值 (melting temperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性 (internal stability, 用 ∆G 值反映) ，形成引物二聚体(primer dimer)及发夹结构（duplex formation and hairpin ）的能值，在错配位点 （false priming site ）的引发效率，引物及产物的 GC 含量（composition ），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点， 引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点： 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp ，但不应大于38，因为过长会导致其延 伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应[2] 。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是 3’端相似性较高的序列，否则容易导 致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增 加[2] 。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不