纤维素酶EGA基因在枯草芽孢杆菌中的表达及其产物性质研究.pdfVIP

浙江理工大学学报，第30卷，第3期，2013年5月 of Sci—Tech Journal Zhejiang University 2013 V01．30，No．3，May 文章编号：1673—3851(2013)03—0389—05 纤维素酶EGA基因在枯草芽孢杆菌中的 表达及其产物性质研究 张漫莉，耿新伟，王梦婷，蒋磊，赵辅昆，陈玮 (浙江理工大学蛋白质组学与分子酶学实验室，杭州310018) 摘要：枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis是一种高效的外源蛋白表达茵株，能将目的蛋白分泌到细胞外的培养 基中。从福寿螺胃液共生菌株Bacillus sp．StrainAC_1基因组中克隆纤维素酶EGA的基因序列，利用基因工程技 术构建纤维素酶EGA的重组枯草芽孢杆菌表达栽体pAUsp_ega。该载体含有一个强启动子和一段信号肽，经淀粉 诱导能表达外源蛋白。以枯草芽孢杆菌蛋白酶缺失型茵株WB700为宿主茵，表达得到的重组纤维素酶EGA以羧 120 甲基纤维素钠(CMC-Na)为底物得到的培养基上清酶活力达到1U／L。该纤维素酶在pH6．0表现最大水解活 力，最适反应温度为60℃，在酸性条件下稳定性良好，具有较好的应用前景。 关键词：枯草芽孢杆茵；纤维素酶EGA；分泌；羧甲基纤维素钠 中图分类号：Q786 文献标志码：A 糖酶随机作用于纤维多糖内部无定形区，产生大 0引言 量的寡糖和新末端。外切争1，4一葡聚糖酶作用于 纤维素是自然界中分布广泛的可再生资源，如 这些还原性或非还原性的末端，产生纤维二糖， 农业废弃物(稻草、秸秆、甘蔗渣等)、食品加工废弃 p1，4一糖苷酶将纤维二糖分解成两分子的葡萄 物(果皮、果渣等)、木材废弃物(木屑、树皮等)及城糖[9]。纤维素酶EGA是由福寿螺胃液中分离出 市废弃物(废纸)等都是纤维素的丰富来源。地球上 的共生菌株Bacillus AC-1所产的一种纤 sp．Strain 每年光合作用可产生大于100亿吨的植物干物质， 980 维素内切酶。编码该酶的基因含有l bp的开 其中一半以上是纤维素和半维素[1。3]。纤维素是植放阅读框，编码659个氨基酸残基[10|。该酶具有 物干物质中细胞壁的主要成分，约占植物干重的 较好的热稳定性且在酸性条件下相对稳定，有较 35％～50％[4]。如果能有效地利用生物技术将纤维好的工业应用前景。 素物质转化成简单糖，继而再发酵生产乙醇等生物 枯草芽孢杆菌是一类好氧型、内生抗逆孢子的 能源物质，将对解决能源危机、环境污染等一系列问 典型的革兰氏阳性杆状细菌，可作为基因工程表达 题有重要意义[5]。 ’ 的宿主菌。与大肠杆菌等表达系统相比，枯草芽孢 纤维素酶(cellulase)是一类能将纤维素水解成 杆菌具有蛋白分泌能力强[11|、遗传背景清晰[12]和不 纤维二糖和葡萄糖等简单糖的多种酶组成的复合 含内毒素[13-141等优点。 本文从Bacillus AC-1基因组中克 酶体系，包括内切p1，4一葡聚糖酶(endo-1，4-1]-glu— sp．Strain canase，EC3．2．L4)、外切p1，4一葡聚糖酶(e