产挥发性杀线虫物质韦氏芽孢杆菌MC67菌株培养条件的优化.pdfVIP

? 中国生物防治年 月 产挥发性杀线虫物质韦氏芽孢杆菌 菌株 培养条件的优化 李志芳 ,顾英琦 ,莫明和 ,何月秋 .云南农业大学农业生物多样性与病虫害技术控制教育部重点实验窒,昆明 .云南大学生物资源保护与利用重点实验室 摘要:采用液体培养,研究了 种碳源、 种氮源成分对韦氏芽孢杆菌。。一菌株 产挥发性物质杀线虫活性的影响。以单因素分析法,确定了 菌株杀线 虫活性的最佳碳源和氮源分别为麦芽糖和酵母膏。采用? 设计法,对影响菌株 杀线虫活性的主要因素进行筛选,确定影响该菌株发酵液挥发物杀线虫活性的 个重要 因子依次为麦芽糖、酵母膏、温度和 值。采用响应曲面法研究 个显著因子的最佳水平,通 过对二次多项回 方程求解得知,当麦芽糖 . / 、酵母膏 . / 、培养温度 . ℃、 值 . 时,菌株发酵液挥发物杀线虫活性的预期值为 . %。对模型培养基验证的结果表明,该 菌株对松材线虫的杀线虫活性为 . %,接近预期值。 关 键 词:韦氏芽孢杆菌;松材线虫;挥发性物质; ? 设计;响应曲面法 中图分类号: . ;. 文献标识码: 文章编号:?? ?? , ,? ,? ,? . , . , ,:, .. , . ?. .: , ,., , 收稿日期:? ? 基金项目:国家自然科学基金 ;云南省自然科学基金作者简介:李志芳一 ,博士研究生; 并列第一作者; 通讯作者,博导,:. 。 中国生 物 防 治 第 卷 . ,: ./ ,. / . .. ., . %, . % . :; ;; ? ? ; 在我国,松材线虫 对松林的危害被称“无烟的森林火灾”,云南 省烟草根结线虫发病面积达 . 万,估计直接经济损失超过万元】。目前化学防治 一 直是对线虫防治采取的主要对策,但与之俱来的易产生抗药性、成本高、生态环境破坏、对人 畜健康的负面影响等一系列问题使人们对生物防治充满了期待。至今已发现了大量具有杀线 虫活性的生防微生物,主要包括捕食线虫真菌、产毒真菌、分泌杀线抗生素的放线菌和细菌等, 但其活性物质均为固态代谢物 。微生物的代谢物中蕴含着丰富的、极易被人们忽视的挥 发性物质,其中一些具有较好的抑菌和杀菌活性 。在我们的前期研究中,筛选到一株细菌 菌株??韦氏芽孢杆菌 ,可以产生 种烷烃类 壬烷、十二烷、 十四烷、十六烷 、】种烯烃类 环己烯 、 种醇类辛醇、十六醇、苯乙醇、松油醇 、 种醛类 葵 醛、苯乙醛 、 种酮类丙酮、壬酮、苯乙酮、十一酮 、 种酸类 丙酸 、 种酚类 苯酚 和 种 醚类二甲基二硫醚 杀线虫挥发物 。 本研究采用? 设计法对影响菌株 杀线虫活性的主要因素进行 筛选,采用响应曲面法』 研究碳源、氮源、温度、 值 个显著因子的最佳水平范围,及其对 菌株 挥发物杀线虫活性的影响。 材料与方法 . 培养基 真菌、线虫和细菌的培养分别为、 和牛肉膏蛋白胨培养基;基础培养基采用? 等Ⅲ 方法配制。 . 供试菌株与线虫及其培养 韦氏芽孢杆菌菌株由本单位菌种保藏中心提供,菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上划 线,于 ℃下过夜培养之后取一环菌体于不同碳、氮源的供试液体培养基中, ℃、 /培养,获得的培养液用滤膜孔径为 . . 的细菌过滤器将菌体过滤所得的滤液用来 测定其挥发物对线虫的活性。松材线虫为云南大学菌种保藏中心保存,以培养基上生长 的灰葡萄孢培养。 . 细菌挥发性物质杀线虫活性测定 在三格培养皿中的第一、二格倒入 培养基,冷却后每格分别加入约条松材线虫。 将细菌培养液加入培养皿的第三格中并用 膜封边。将各处理于 ℃放置 后 在 倍光学显微镜下观察线虫活性并统计线虫死亡率。每个样品观察 个视野,总计数的线 虫数不低于条。以同体积的细菌液体培养基为空白对照;每个样品 次重复。 . 不同碳、氮源对菌株杀线虫活性的影响 用供试的 种碳源 表 分别替换基础培养基中的麦芽糖,均加入 / 。确定碳源后, 第 期 李志芳等:产挥发性杀线虫物质韦氏芽孢杆菌 菌株培养条件的优化 用供试的 种氮源 表 分别替换基础培养基中的 ,每升培养基中分别加入 . 。将 菌株 于各处理培养基培养 ,测其发酵液挥发物的杀线虫活性。 . 培养基配方的优化方案设计 . . ? 试验设计 将基础发酵培养基中的 个组分和 个培养条件作为影响 因素进行全面考察,选择因子两水平的试验设计。设、 、 为空项以估计试验误差;以、 、 、 、 、 、 、、 分别代表麦芽糖、酵母膏、 、 、 、、温度、 、转速,每个因素取高低两个水平,共 个处理表 、 。 . . 响应面 试验设计 采用 ? 中心组合设计。将影响菌株 杀线虫 活性的 个关键因子进行优化试验,每个因素