丙酮对溶栓酶活力的动力学初步探究.pdfVIP

第34卷第2O期 帼 药杂志 Vo1．34，Issue 20 hinaJourna 。neseMateriaMedica October，2009 2009年 1O月 C 丙酮对溶栓酶活力的动力学初步探究 林光关 ，陈明 ，杨菁 ，汪世华 (1．福建农林大学 作物学院，福建 福州 350002； 2．福建农林大学生命科学学院，福建福州 350002) [摘要] 目的：研究丙酮对枯草芽孢杆菌溶栓酶活力的影响及抑制动力学。方法：用SephadexG一100凝胶柱色谱分离纯 化酶，以四肽底物法测定酶活，选择丙酮为效应物，测其对溶栓酶的影响。最后，用Lineweaver—Burk双倒数作图法，比较酶催 化的动力学参数，确定抑制剂的类型，测定抑制常数。结果：当丙酮浓度增大时，溶栓酶的酶活力损失越严重。在含不同浓度 丙酮的测活体系中，随着丙酮浓度的增大 ，直线的斜率降低。在双倒数图中， 值随着丙酮的增大而减小，而 值随着丙酮 的增大而增大。测得丙酮对酶的抑制常数 ，K，分别为 1．25，3．17。结论：丙酮对溶栓酶有抑制作用。丙酮对酶的抑制作用 是可逆过程，抑制类型为混合型抑制。 [关键词] 溶栓酶；丙酮；抑制；动力学 枯草芽孢杆菌是从豆豉中分离出来的高产溶栓 挑取 LB斜面培养基上菌落，转接到装有 50mL 酶的菌株，枯草杆菌溶栓酶是从枯草芽孢杆菌发酵 LB的液体培养基中，于恒温振荡培养箱 中，37℃， 的产物中发现的一类具有溶血栓作用的酶，这类酶 200r·rain 活化并扩大培养 l0—12h。 不仅可以抑制血栓的形成，同时还能显著地溶解体 2．2 产酶培养 内外血栓，缩短血球蛋白溶解时间，并能激活静脉内 将扩大培养后的菌液以2％的接菌量转接至发 皮细胞产生纤维蛋 白的溶酶原激活剂 (t．PA)，最终 酵培养基中，32℃，180r·min～，恒温震荡培养，发 将血栓水解成小肽及氨基酸，从而间接表现其溶纤 酵72h。发酵培养基配方：4％豆粕粉，2％大米粉 ， 维活性，且溶血栓效果大于传统的纤溶酶和弹性蛋 0．04％ CaC12，0．4％ K2HPO4 ·3H20，0．2％ 白酶，安全性高…。 KH2PO4，0．07％ MgSO4 ‘10H20，pH 7．4。 近几年，随着非水酶学的兴起，酶在有机溶剂中 2．3 溶栓酶的纯化 的催化作用受到越来越多的关注。本课题组在筛选 2．3．1 盐析 收集发酵液，将其置于4℃，9000r 到高产溶栓酶菌株，研究有机溶剂对溶栓酶活力影 ·rain一下，离心20rain，收集上清液。向上清液中 响时 ，发现丙酮有许多有别于其他有机溶剂的地 加入 35％饱和度的硫酸铵，于磁力搅拌器上低温充 方 ，因此本实验进一步从动力学的角度深入研究丙 分溶解 ，4℃沉淀 7h，同样温度 ，9000r·min。。离 酮对溶栓酶的影响。 心20rain，取上清液。再 向上清液 中加入 70％饱和 1 材料 度的硫酸铵，置于磁力搅拌器上低温充分溶解 ，沉淀 四肽底物 Suc—Ala—Ala—Pro—pNA(上海生物工程 过夜，4oC，6000r·rain 离心20rain，取沉淀。将 公司)；酵母粉、胰蛋 白胨 (OXOID公司)；其他试剂 收集到的沉淀用Tris—HC1(pH8．0，0．05mol·L ) 均为 国产分析纯。