大鼠灌服复方丹参方后血清中丹参素的测定.docVIP

大鼠灌服复方丹参方后血清中丹参素的测定 潘桂湘(，张伯礼，高秀梅 （天津中医学院中医药研究中心，天津300193） [摘要] 目的：了解大鼠ig复方丹参方后水溶性成分的吸收情况，建立大鼠血清中丹参素的含量测定方法。方法：采用液液萃取法对血清样品进行预处理，以对羟基苯甲酸为内标，甲醇-乙腈-0.5%醋酸（2.5：3.5：94）为流动相，用高效液相色谱法于281nm检测。结果：大鼠ig复方丹参方后在血清中检测到丹参素，用所建立的方法绘制了其经时血药浓度曲线；而原儿茶醛则未在血清中发现，检测到的是一个保留时间稍前于原儿茶醛的未知化合物。结论：大鼠灌服复方丹参方后，丹参素可经胃肠道吸收入血，呈快吸收慢消除的过程。 [关键词] 复方丹参方；丹参素；高效液相色谱法；体内药物分析 复方丹参方由丹参、三七及冰片组成，具有活血化瘀，理气止痛之功效，是临床治疗冠心病、胸闷、心绞痛的常用中药处方。方中的化学成分根据其理化性质和药理作用的差异，可将之分为丹参水溶性成分、丹参脂溶性成分和三七皂苷类成分三大类。丹参水溶性成分含有多种酚酸类化合物，该类成分具有很强的抗脂质过氧化、抗血栓等作用[1]，可能是复方丹参方中的主要活性部位。 传统中药多为口服制剂，其有效物质往往以血液为介质而输送到靶点产生作用。就此而言，给药后的血清才是真正起作用的“粗的药物”[2]。所以，中药的药效物质基础应该在给药后的血清组成中进行探讨[3]。虽然近年来国内对复方丹参方的研究较多，但对该方药效物质基础进行深入探讨的研究则相对很少。通过研究复方丹参方动物给药后血清中的成分及其相应的药理作用，则可以更直接地了解到复方中真正起作用的化学物质基础。所以本文对大鼠灌服复方丹参方后丹参水溶性成分的吸收状况进行了研究，并建立了血清中丹参素的HPLC测定方法，为进一步阐明其药效物质基础提供科学的依据。 1 材料与方法 1.1 材料 仪器 HP1100高效液相色谱仪，G1311A-四元泵，G1322A-脱气机，G1316A-柱温箱，1314A-UV可变波长检测器，HPRev.A.0501化学工作站。 试药 甲醇、乙腈为色谱纯，水为超纯水，冰醋酸、乙酸乙酯为分析纯，丹参素、原儿茶醛对照品（中国药品生物制品检定所），对羟基苯甲酸（化学纯），三氯醋酸（分析纯），复方丹参方药液（取丹参和三七提取物适量，加蒸馏水配制成生药量比为10：6的药液）。 动物 SD大鼠，雌雄各半，体重(200±10)g，北京维通利华实验动物中心提供。 1.2 色谱条件 Hypersil C18（5μm）4.6mm×250mm色谱柱，甲醇-乙腈-0.5%醋酸（2.5：3.5：94）为流动相，流速为1.0mL·min-1，检测波长为281nm，色谱图见图1。 1.3 样品的处理与测定 精密量取血清样品1.0mL，加入1%醋酸50μL，内标溶液50μL，10%三氯醋酸溶液200μL，用涡旋混合器混旋1min，12000r·min-1离心10min。将上清液转移至具塞尖底离心试管中，用4mL乙酸乙酯旋涡混合提取1min，3000 r·min-1离心2min，分取有机层，于45℃水浴上通N2流挥干。临用前残渣用甲醇50μL溶解，超声1min，旋涡混合1min，离心（12000 r·min-1）10min，取上清液10μL进样，以内标工作曲线法[4]求算丹参素的血药浓度。 1.4 标准曲线的绘制 1.4.1 标准贮备液配制 精密称取4.0mg丹参素于10mL容量瓶中，用1%醋酸定容至刻度，然后取适量用1%醋酸稀释成浓度为0.016，0.04，0.08，0.16，0.24，0.8mg·mL-1的丹参素标准溶液。另精密称取4.1mg对羟基苯甲酸于10mL容量瓶中，用1%醋酸稀释至刻度，再取1mL稀释至10mL作为内标溶液。 1.4.2 标准曲线的制备 精密量取空白血清样品1.0mL，加入不同浓度的丹参素标准溶液50μL，内标溶液对羟基苯甲酸50μL，10%三氯醋酸溶液200μL，按“1.3样品的处理与测定”方法进行处理与测定。以丹参素与内标物的峰面积比值（Y）为纵坐标，丹参素浓度（X）为横坐标，用最小二乘法进行线性回归。 1.5 给药方案与样品采集 SD大鼠随机分组，每组3只（即每个取样时间点3只），实验前12h禁食，不禁水。除空白组大鼠外，各组大鼠按2.5mL·100g-1剂量灌服复方丹参方药液。大鼠于灌服前和灌服后15，30，45，60，75，90，120，180，240，360min心脏采血，37℃水浴温孵后，离心10min（3000 r·min-1），分离血清。 2结果 2.1 丹参素经时血药浓度测定结果 取血清样品1.0 mL，按“1.3样品的处理与测定”进行操作，得大鼠ig复方丹参方药液后丹参素的经时血药浓度，结