花生AhAO1蛋白的原核表达、纯化及抗体制备.pdfVIP

豆熬带槛 钭孝2010,394()：4—6． 花生AhAO1蛋 白的原核表达、纯化及抗体制备 杨丽霞 ，一，宋涛平 ，彭新凯 ，胡朝晖 ，李 玲 2 (1．长沙市食品质量安全监督检测中心，湖南 长沙 410013；2．华南师范大学 生命科学学院，广东省植物发育生物工程 重点实验室，广东 广州 510631) 摘 要：采用RT-PCR方法，以花生叶片RNA逆转录得到的cDNA为模板，扩增出AhAO1基因片段 ，将其插入原 核表达载体pPROEXHTa中，构建AhAO1基因片段原核表达载体HTaAhAO1，经PCR和测序确证后，以IPTG诱 导其在E coliBL21中高表达His—AhAO1融合蛋白，采用亲和层析柱与电泳纯化融合蛋白。用纯化的His。AhAO1融 合蛋 白制备抗体，为分析AhAO1的功能奠定基础。 关键词：花生；AhAO1；pPROEXHTa；原核表达；抗体 Doi：10．3969~．issn．1009—7791．2010．04．002 中图分类号：Q943．2 文献标识码：A 文章编号：1009．7791(2010)40．0004—03 ProkaryoticExpression，PurificationandPolyclonalAntibodyPreparationof PeanutAhAO1Pr0tein YANG Li—xia，，SONG Tao—ping，PENG Xin—kai，HU Zhao—hui，LILing (1．ChangshaCenterofSupervision InspectiononFoodQua1i够Salty，Changsha410013，HunanChina；2．GuangdongKey LabofBiotechnologyforPlantDevelopment，CollegeofLifeScience，SouthChinaNormalUniversity,Guangzhou510631， GuangdongChina) Abstract：TheAhA01genewasisolatedby r_PCR using cDNA synthesized from totalRNA extracted rfom peanut leavesand cloned into plasmid pPROEXHTal．The expression plasmid }rraAhAo1wasrtansformedintoE coliBL21．SDS—PAGe naalysisrevealed tllattheHis—AhAO1 fusionproteinwashighly expressedni E coliBL21nadpurifiedbv amnity chromatography and electrophoresis．TheHis-AhAOlpolyclonal antibodywaspreparde andtested by western blot．1]he na ti—HiS—AhAO1polyclonalna tibodylaysfoundationforfurtherresearchonAllAo1． Key words：Arachishypogaea；AhAO1；pPROEXHTa；prokaryoticexpression；na tibody 醛氧化酶(aldehydeoxidase，AO)是钼单加氧酶和Fe—s黄素蛋白家族的成员 】【J，与多种化合物的代谢 过程有关。已知植物AO主要参与ABAL2J和IAAL3的生物合成。研究发现，纯化的玉米AO分子量约300 kDa，由两个150kDa亚基组成 。通过对其测序，克隆了两个A0cDNA(ZrnAO一1和ZmAO一2)j。目前 从拟南芥6【J、豌豆L7】、番茄L8J和花生 】【叫等植物中克隆了AO基因。本文构建抗旱花生品种AhAO1基因片 段HTaAhAO1原核表达载体，获得原核表达重组蛋白，并制备AhAO1抗体，为研究花生在干旱、盐等 胁迫条件下的AhAO1蛋 白表达及其作用奠定基础。 1 材料与方法 1．1菌株 、质粒和材料 E．coliBL21、pPROEXHTa质粒为本实验室保存。 1．2主要试剂 镍亲和层析柱购 自Novagen公司；各种 DNA限制性内切酶、T4DN