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什么是751型分光光度计？ 是一种可供从紫外光到红外光区（200～1000 nm）测量吸收光谱的较高级分光光度计。 在波长320～1000 nm内，用钨丝白炽灯泡作光源，在波长200～320 nm范围内，用氢灯作光源。 使用方法（自学） 知识拓展P31 1、分光光度技术简介 2、考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量 分光光度技术简介 基本原理 分光光度计的基本结构 基本应用 朗伯－比尔（Lambert-Beer）定律 比色分析的基本原理：研究有色溶液对单色光的吸收程度与溶液及液层厚度间的定量关系 吸光度与溶液的浓度和液层的厚度的乘积成正比 基本原理 分光光度计基本结构简介 由五部分组成：光源、单色器、狭缝、样品池、检测器系统 ①光源：要求能提供所需波长范围的连续光谱，稳定而有足够的强度 常用:白炽灯（钨灯、卤钨灯等），气体放电灯（氢灯、氘灯、氙灯等），金属弧灯（各种汞灯）等 钨灯和卤钨灯：发射320～2000nm连续光谱，最适宜工作范围为360～1000nm，稳定性好，用作可见光分光光度计的光源，灯管发黑及时更换； 氢灯和氘灯：发射150～400nm的紫外光，可用作紫外光区分光光度计的光源，接触灯管应戴手套 ②分光系统（单色器）：是指能从混合光波中分解出来所需单一波长光的装置，由棱镜或光栅构成。 用玻璃制成的棱镜色散力强，但只能在可见光区工作； 石棱镜工作波长范围为185～4000nm，在紫外区有较好的分辩力，而且也适用于可见光区和近红外区。 ③狭缝：是指由一对隔板在光通路上形成的缝隙，用来调节入射单色光的纯度和强度，也直接影响分辩力 狭缝可在0－2mm宽度内调节，由于棱镜色散力随波长不同而变化，较先进的分光光度计的狭缝宽度可随波长一起调节 ④比色皿：比色杯、样品池、吸收器，用来盛溶液，各个杯子壁厚度等规格应尽可能完全相等，否则将产生测定误差 玻璃比色杯只适用于可见光区，在紫外区测定时要用石英比色杯 不能用手指拿比色杯的光面，用后要及时洗涤，可用温水或稀盐酸，乙醇以及铬酸洗液（浓酸中浸泡不要超过15分钟），表面只能用柔软的绒布或拭镜头纸擦净 ⑤检测器系统：检测器产生的光电流以某种方式转变成模拟的或数字的结果，模拟输出装置包括电流表、电压表、记录器、示波器及与计算机联用等，数字输出则通过模拟／数字转换装置如数字式电压表等 分光光度技术的基本应用 ①测定溶液中物质的含量 I. 测定标准溶液（浓度已知的溶液）和未知液（浓度待测定的溶液）的吸光度，进行比较，可得出未知液的浓度（前提：所用比色皿的厚度一样）； II. 先测出不同浓度的标准液的吸光度，绘制标准曲线，在选定的浓度范围内标准曲线应该是一条直线，然后测定出未知液的吸光度，即可从标准曲线上查到其相对应的浓度。 所用波长通常要选择被测物质的最大吸收波长：⑴灵敏度大；⑵可以避免其它物质的干扰。 ②用紫外光谱鉴定化合物 各种物质有它自己一定的吸收光谱曲线，因此用吸收光谱曲线图可以进行物质种类的鉴定。 注意：同一种物质的紫外吸收光谱应完全一致，但具有相同吸收光谱的化合物其结构不一定相同。除了特殊情况外，单独依靠紫外吸收光谱决定一个未知物结构，必须与其它方法配合。 应用：主要用于已知物质的定量分析和纯度分析。? 基本原理 考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过疏水作用结合后，变为蓝色，可在595nm比色测定。 测定蛋白质浓度范围为0.01～1.0g/L。 优缺点 优点：反应快、操作简便，消耗样品最少。 缺点：不同蛋白质之间差异较大，且标准曲线线性较差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵、去垢剂对测定有干扰。缓冲液浓度过高，改变测定液pH会影响显色。 注意事项 考马斯亮蓝的染色能力很强，比色皿不洗干净会影响吸光度值。 不可使用石英比色皿 操作过程（自学） 课外训练P35 第二课堂P35 1、双缩脲法、福林-酚试剂法、紫外吸收法测定蛋白质含量的依据分别是什么？ 2、上述三种方法的优缺点有哪些，分别适用哪些场合？ 3、分光光度计使用中有哪些主要的注意事项？ 任务二理论重点 三种蛋白质含量测定方法的比较？（原理、优缺点、适用对象） 分光光度计的使用方法及主要注意事项 岗前准备 预习任务三：猪血清蛋白的电泳分离纯化 要求：了解电泳的原理，以及聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤 * 分任务二 用紫外吸收法测定蛋白质含量，评价分级盐析猪血清蛋白的效果（最佳盐析区间） 实践操作 浏览实验过程（紫外吸收法部分），思考： 1、3种紫外吸收法是否都适用？ 2、表1-3中，是否可用去离子水代替磷酸缓冲液？ 3、方法II、III中的对照品是什么？ 4、三种方法能够测定的蛋白质浓度范围？ 5、紫外分光光度计怎么