出口虎豹制品中虎、豹成分检测方法 PCR-RFLP方法.docVIP

出口虎豹制品中虎、豹成分检测方法 PCR-RFLP方法.doc

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ICS SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T XXXXX—XXXX 出口食品中产毒真菌 拟枝镰刀菌的检测 出口制品中虎、豹、狮成分的检测方法 PCR-RFLP方法 Identification of tiger leopard and lion derived materials in export product -PCR-RFLP method XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 前言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准主要起草单位:中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。 本标准主要起草人:刘淑艳、蒋丹、宋惠君马惠蕊、卢行安、曹际娟 出口制品中虎、豹成分检测方法 PCR-RFLP方法 范围 本标准规定了虎、豹、狮成分的PCR-RFLP检测方法。 本标准适用于虎、豹、狮物种及其制品中虎、豹、狮成分的定性检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 术语、定义和缩略语 下列术语和定义适用于本文件。 术语和定义 PCR polymerase chain reaction, 聚合酶链式反应,简称PCR 虎源性成分 tiger derived materials 虎特异性DNA片段 豹源性成分 leopard derived materials 豹特异性DNA片段 狮源性成分 lion derived materials 狮特异性DNA片段 简并引物Degenerate Primer 简并引物是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。核苷酸链中除出现正常的A、T、G、C四种碱基符号外还出现如R、Y、M、K等其它字母(其中R=A/G,Y=C/T,M=A/C,K=G/T,S=C/G,W= A/T,H= A/C/T,B= C/G/T,V=A/C/G, D=A/G /T,N=A/C/G/T)。 缩略语 DNA:deoxyribonuleic acid,脱氧核糖核酸。 Taq:Thermus aquaticu,水生栖热菌。 RFLP: Restriction Fragment Length polymorphism, 限制性片段长度多态性 原理 利用裂解液破碎细胞,三氯甲烷抽提蛋白质,无水乙醇沉淀得到DNA;以提取的DNA为模板进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物;PCR阳性产物应用限制性内切酶酶切反应进行确证。 试剂和材料 除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂。实验用水应符合GB/T 6682中一级水的规格。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。 检测用引物(对)序列:见表1。 表1 引物序列 被检测基因 基因名称 引物序列(5’-3’) 目的片段长度(bp) 哺乳动物通用引物 L14724 H15149 5'-GATATGAAAAACCATCGTTG-3' 5'-CTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3' 423 虎、豹、狮特异性引物 PL1 Fa PL2 Rb 5’ –CYAAYAACCCCTCAGGAATGGT-3’ 5’ –CGTTGTTTGGAWGTGTCCAGRGC-3’ 虎326 豹326-327 狮 326 注:Fa 为Forward(正向),Rb为Reverse 反向。 Taq DNA 聚合酶。 限制性内切酶:HinfI酶、MboI酶。 RNA 酶溶液:5 μg/μL。 三氯甲烷。 异戊醇。 异丙醇。 无水乙醇。 70%乙醇。 琼脂糖;电泳纯。 溴化乙锭:10 mg/ mL。 DNA分子量标准品100 bp~。 裂解液:1%CTAB(cetyltrithylammonium bromide, 十六烷基三甲溴化铵),0.05mol/L Tris-HCl(pH8.0)[Tris-: tris (hydroxymethyl) aminomethane, 三(羟甲基)氨基甲烷],0.7mol/L NaCl,0.01mol/L EDTA(pH8.0)(ethylene diaminetetraacetic acid, 乙二胺四乙酸)。 TE缓冲液(Tris-Cl、EDTA缓冲液):10 mmol/L Tr

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