出口花粉中链霉素和双氢链霉素的检测方法 编制说明.doc

《出口花粉中链霉素和双氢链霉素的测定方法》 编制说明 一、标准制定的任务来源及意义 1、任务来源 本标准是根据国家认证认可监督管理委员会下达的任务，名称为《出口花粉中链霉素和双氢链霉素的测定方法》，计划编号为2012B288K，由中华人民共和国江苏出入境检验检疫局负责制定，本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 2、制定标准的意义 蜂花粉为蜜蜂从显花植物花蕊内采集的花粉粒，混合了蜜蜂分泌的多种活性成分[1]如22种氨基酸、14种维生素、30多种常量和微量元素、94种活性酶、辅酶、植物蛋白等多种生长素、抗衰老物质,而且这些营养物质大多以游离状态存在，易为人体吸收和利用。花粉具有健脑增智提神、护肤美容、抗衰老、防治心血管病、防治前列腺疾病等作用，因此是国际上公认的迄今人们发现的营养成分和功效最完全的物质，被誉为“浓缩的营养库之称” [2]。因此受到包括中国、欧美及日韩等消费者的欢迎。近年来，各国对于蜂花粉的进出口需求逐渐增大，对其质量要求也在不断增加. 链霉素、双氢链霉素（结构式见图1）是一种广谱氨基糖苷类抗生素。在兽医学和畜牧业领域，常常被用于治疗细菌性感染，对污仔病（蜜蜂幼虫的疫病，蜜蜂最常见的一类疾病）具有很好的疗效[3]。但是链霉素长期使用会导致动物体内药物的蓄积，从而通过食物链进入人体及生态系统，众所周知，链霉素最易伤害听觉神经，严重时会导致耳聋，对肾脏也有毒性，而蜂农为了防治蜜蜂幼虫病，常常会不科学的使用链霉素或双氢链霉素[4]，与蜂蜜蜂王浆这些常见蜂产品一样，蜜蜂在加工蜂花粉时，蜜蜂器官的分泌物参与了加工和酿制过程，如果蜜蜂饲养过程中使用了链霉素，那么蜂花粉同样也会存在链霉素残留问题。2009年我国蜂花粉出口受到影响，一方面是全球经济危机的影响，另一个重要的因素就是抗生素问题[5]。 图1 链霉素（A）和双氢链霉素（B）化学结构式 目前国内外对于链霉素和双氢链霉素的检测方法有微生物法[6]，酶联免疫法[7]，气相色谱质谱法[8]，以及近年来多采用的液相色谱法[9-11]和液相色谱-质谱法[12-13]等。微生物方法存在菌种不易筛选，检测时间长，稳定性差以及精确度和灵敏度低等缺点，酶联法虽有较高的敏感性，但常产生假阳性结果，所以常用来进行初筛检测。链霉素具有较强的极性，不易挥发，气相色谱法中常需衍生化。另外，链霉素的结构中因缺少发色团和荧光团，液相色谱法中也常需进行柱前衍生或柱后衍生，这些衍生化方法操作不仅麻烦，并且稳定性不高。 我国现行的检测链霉素和双氢链霉素的国家标准中，针对的基质多是蜂蜜、蜂王浆以及奶制品、水产、饲料、肉制品等[14-18]，但对于蜂花粉的链霉素和双氢链霉素还没有相应的检验方法,并且在整个花粉检测领域中,国内外也没有相关的文献报道,因此,为填补相应空白,控制花粉进出口质量,建立一个花粉中链霉素和双氢链霉素检测的方法非常必要。 二、编制依据 本标准的编制遵循GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则》[19]、GB/T 20001.4-2001《标准编写规则 第4部分：化学分析方法》[20]以及SN/T 0001-1995《出口商品中农药、兽药残留量及生物毒素检验方法标准编写的基本规定》的要求进行编写制订的[21]。 三、标准制定过程 本标准起草单位在2012年1月收到认监委的任务下达文件后，立刻开始着手进行标准文本、编制说明和验证工作。 本标准起草人通过查询相关资料和文献，结合国内外文献中已有的检测基础，建立了花粉中链霉素和双氢链霉素的检测方法。经实验研究验证后，方法的灵敏度、特异性和选择性均能满足相应的检测要求。 四、主要实验技术内容 1 样品前处理条件的优化 1、提取溶剂的选择 由于链霉素和双氢链霉素是强极性物质，水溶性较大，因此本文结合文献，比较了水、庚烷磺酸钠以及磷酸盐缓冲液（pH为6-7）三种水性提取液，同一浓度的链霉素被提取后，在色谱图上的峰面积体现了提取效率，参见表1。实验表明：水的提取效率最差，庚烷磺酸钠以及磷酸盐缓冲液的提取效率相当，可结合后期的固相萃取柱净化方式适当的选择这两种提取溶剂。 表1 同一浓度不同提取溶剂的提取待测物的峰面积 水 庚烷磺酸钠 磷酸盐缓冲液 峰面积 链霉素 ７４０７ １３０１８ １４４１１ 双氢链霉素 １１２４３ ３７９５１ ４３０３５ 2、蛋白沉淀剂选择 参照相关的文献方法中，高氯酸、三氯乙酸和三氯甲烷常常在蜂蜜、蜂王浆中用作沉淀蛋白效果较好的沉淀剂，本文考察了三者在花粉中的沉淀效果发现：高氯酸和三氯乙酸在沉淀蛋白上有一定的效果，但是沉淀后的液体仍较混浊，会导致过柱过程中堵塞小柱。而三氯甲烷不仅沉淀了较多的蛋白质，而且还能同时去除花粉中脂溶性成份如脂溶性维生素、黄酮类化合物等，沉淀后的液体虽