条斑紫菜原生质体无菌培养体系建立及转基因研究.pdfVIP

——鳖苤堕圭堕堡歪堕揸鲞堡墨盐垄塞垦整董里型壅 条斑紫菜原生质体无菌培养体系的建立及转基因研究 摘 要 ／紫菜是世界上人工栽培海藻中经济价值最高的--}0e，它已成为我国海藻养 殖、亚的支柱品种和主要的出口创汇海产品。紫菜营养价值丰富，含有人体必需 的多种营养成分。紫菜属异型世代交替型生活史，藻体形态结构简单，细胞发 育分化易于调控：叶状体时期是单倍体世代，染色体数为2～7条，基因组大小 是2．7—5_3×108 bps。紫菜原生质体的制各和再生技术已经成熟，室内培育原生 质体成苗仅需几个月。因此紫菜被公认为是海洋植物基础和应用研究理想的模 式生物。但近年来由于品质退化的原因，紫菜养殖业爆发了大规模的病害，造 成了严重的经济损失。因此开展紫菜遗传转化研究，培育优质、高产、抗逆的 紫菜新品种具有现实的紧迫性和可行性。J 紫菜遗传转化的开展首先必须建立其原生质体无菌培养体系。但是紫菜藻 体纤细脆弱，渗透性很强，表面附生生物种类繁多，依靠常规的消毒方法很难 Ge02溶液 获得真正无菌的藻体组织。(本实验在原生质体的制备时采取o．8mg／L 浸泡，酶解前反复洗刷8～10次，海螺酶经O．229m滤膜过滤除菌等措施，彻 底杜绝了杂藻和原生动物的污染，良好的实验结果及其稳定的可重复性说明了 无菌培养的可操作性a斗为了实现阳性转化子的定点跟踪观察与定向筛选，首次 成功实现了紫菜原生质体在无菌条件下的固体再生培养，并且首次把高等植物 组织培养中常用的两种激素NAA和6一BA引进到紫菜原生质体的固体培养 中，显示出良好的促生长作用．证明了高等植物激素在紫菜原生质体培养中的 有效性，同时电为条斑紫菜生长发育过程中相关生理生化机制的研究提供了一 个新的切入点。 为了筛选有效的遗传选择标记，首次进行了紫菜原生质体对8种常用抗生 素的敏感性研究。蜮验结果表明Zeocin、腐草霉素和氯霉素对紫菜叶状体细胞 作用明显，在低浓度下即有致死作用，适合作为紫菜稳定遗传转化研究的选择 压力；另外五种抗生素的致死作用较差，其中四环素盐酸盐和氨苄青霉素有较 鐾墨堕兰堕堡垄堕堑鲞签墨堕望宴壁堑堇里坚塞 ! 明显的生长抑制作用，延缓细胞的分裂与分化，使其大部分形成棕褐色V．3flJI胞 团，不同之处在于前者促进单孢子放散；卡那霉素，新霉素和硫酸链霉索抑制 作用不明显，其中高浓度的卡那霉素有促假根生长的作用。一 实验中利用外源启动子CaMV35S构建了表达载体，采用电转化的方法丌展 的存活率在40％左右：通过荧光测定口一葡糖醛酸酶的活性，发现试验组的原生 质体提取液与空白对照组相比荧光值有明显升高，组织化学染色后有蓝色的细 胞呈现。证明已成功地将GUS基因转入紫菜原生质体，实现了GUS基因的瞬间 表达： 综上所述，本论文首次建立了条斑紫菜原生质体的无菌培养体系，并证明 了高等植物激素NAA和6一BA在紫菜原生质体固体培养中的促生长作用；确立了 阳性转化子筛选的遗传选择标记：建立了适合紫菜原生质体的电转化方法，实 现了外源GuS基因的瞬间表达，为紫菜稳定性遗传转化的开展和转基因新品种 的培育奠定了基础■ 关键词：条斑紫菜；无菌体系；固体培养：遗传选择标记；瞬间表达 紫菜原生质体无菌培养体系的建立及转基因研究 StudiesontheAxenicCulture and System Genetic Transformation in只yezoensis Protoplast Abstract the in most roleth