第四章酶的提取与分离纯化.pptVIP

第一节 细胞破碎 第二节 酶的提取 第三节 酶的分离纯化 第四节 工业生产中酶纯化过 程的生物安全措施 第一节 细胞破碎 细胞破碎方法及其原理 第一节 细胞破碎 机械破碎法 第一节 细胞破碎 物理破碎法 第一节 细胞破碎 化学破碎法 第一节 细胞破碎 酶促破碎法 第二节 酶的提取 酶的提取是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。也称为酶的抽提 首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂 大多数酶能溶解于水，可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液提取 有些酶与脂质结合或含较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取 为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中，要注意控制好温度、pH值等各种条件 二、影响酶提取的主要因素 1、温度 为了防止酶的变性失活，提取时温度不宜高 特别是采用有机溶剂提取时，温度应控制在0～10℃（有些酶对温度的耐受性较高，如酵母醇脱氢酶、细菌碱性磷酸梅、胃蛋白酶等，可在37℃或更高一些温度下提取） 在不影响酶的稳定性的条件下，适当提高提取温度，可以提高酶的扩散速率，增加酶的溶解度，有利于酶的提取和进一步的分离纯化 二、影响酶提取的主要因素 2、pH值 溶液的pH值对酶的溶解度和稳定性有显著的影响 为了增加酶的溶解度，提取时溶液的pH值应该远离酶的等电点 但是除了酸溶液提取或碱溶液提取者以外，提取时溶液的pH值不宜过高或过低，以防止酶的变性失活 二、影响酶提取的主要因素 3、提取液的体积 提取液的用量增加，可提高提取率 过量的提取液，使酶浓度降低，对进一步的分离纯化不利 提取液的用量一般为含酶原料体积的3～5倍。可一次提取，也可分几次提取，若辅以缓慢搅拌，则可提高提取率 第三节 酶的分离纯化 酶的提纯手段一般都是依据酶的分子大小、形状、电荷性质、溶解度、专一结合位点等性质而建立的。要得到纯酶，往往需要将各种方法联合使用 第三节 酶的分离纯化 一、调整酶溶解度的方法 1、改变离子强度 蛋白质在溶液中由于表面带电的氨基酸残基与溶剂分子相互作用，所以能保持溶解状态 低浓度盐离子——盐溶 高浓度盐离子——盐析 大部分酶在细胞中呈溶解蛋白的形式存在(达细胞总量40％)，在中性pH和离子强度为0.15～0.2mol/L的生理条件下极易溶解 第三节 酶的分离纯化 一、调整酶溶解度的方法 2、改变pH或温度 将溶液pH调到酶的等电点，可使酶沉淀析出 （但在末纯化前等电点一般是未知的，需慢慢摸索，对某一特定的酶而言，pH变化范围不易过大，以免酶失活） 利用温度的变化来改变酶溶解度的方法同pH变化。适于纯化一些对热不敏感的酶 第三节 酶的分离纯化 一、调整酶溶解度的方法 3、改变介电常数（有机溶剂沉淀法） 在溶液中加入与水互溶的有机溶剂，可显著降低溶液的介电常数，从而使酶分子相互之间的静电作用加强而发生沉淀 常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、甲醇等 当溶液中存在有机溶剂时，酶蛋白的溶解度随温度的下降而显著降低，因此尽可能在低温下进行操作 较一般盐析法(如硫酸铵沉淀法)分辨率高。有时仅用这一方法就可将某些酶纯化，用过的有机溶剂可以回收 第三节 酶的分离纯化 一、调整酶溶解度的方法 4、萃取 利用物质在两相中的溶解度不同而使其分离的技术。 有机溶剂萃取 双水相萃取 超临界萃取 反胶束萃取 第三节 酶的分离纯化 二、根据酶分子大小、形状不同的方法 1、离心分离 ⑴　一般离心分离 离心方法在酶分离纯化中最为常用。使用时首先应该考虑如何确定离心转速和离心时间 每种离心机的离心转子一般都列出了在其最大转速时的K因子，K因子可通过下式计算求得 第三节 酶的分离纯化 二、根据酶分子大小、形状不同的方法 1、离心分离 ⑴　一般离心分离 己知K因子后，离心时间t可通过下式估算(单位为小时)： 第三节 酶的分离纯化 二、根据酶分子大小、形状不同的方法 1、离心分离 ⑵ 差速和密度梯度离心分离 差速离心就是对某一悬浮液选用一较低的转速进行离心，分离得到沉淀和上清液，然后对上清液再选用较高的转速进行离心，又得到相应的沉淀和上清液，如此反复操作，以达到分级分离样品的技术 技术简单，分离速度快，较短时间内可把样品分级成多种不同组分 分辨率较差，只适用于粗抽提或浓缩 第三节 酶的分离纯化 第三节 酶的分离纯化 二、根据酶分子大小、形状不同的方法 1、凝胶过滤 由于大的蛋白质分子被凝胶颗粒排斥，因而在颗粒外移动，速度轻快；小分子蛋白质则进入凝胶颗粒的小孔内，路径加长，移动绕腔，从而根据分子大小将各种组分拉开 常用于凝胶过滤的介质有