甘氨酸对肾缺血再灌注损伤的保护作用及对iNOS表达的影响.DOCVIP

临床医学论文-甘氨酸对肾缺血再灌注损伤的保护作用及对iNOS表达的影响 【关键词】? 肾缺血 　　肾缺血再灌注损伤的病理机制非常复杂，研究资料表明，iNOS的过表达参与缺血再灌注损伤病理过程。本研究主要通过检测大鼠缺血后尿量变化、尿生化和肾功能，结合常规病理检查、电镜观察及免疫组化法测定iNOS蛋白表达变化，探讨甘氨酸对肾脏热缺血再灌注损伤的保护作用及作用机制。 ??? 1? 资料与方法 ??? 1.1? 实验动物与试剂? 健康雄性Wistar大鼠24只，体重(250±18)g，购自中科院上海实验动物中心。随机分为假手术组(A组)、对照组(B组)、甘氨酸治疗组(C组)。甘氨酸购自上海生物工程技术有限公司，iNOS免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程公司。 ??? 1.2? 肾缺血再灌注动物模型的制作? 2%戊巴比妥钠60mg/kg腹腔注射麻醉，大鼠仰卧位于恒温手术台上，左股静脉插管，接微泵输注生理盐水(A、B组)或甘氨酸溶液(C组)，速度1mL/(100g·h)。膀胱造瘘，接预先称重的1.5mL微量离心管，收集尿标本。计算尿量变化。输注液体60min后，行腹部正中切口，无损伤动脉夹阻断肾蒂30min。假手术组不上夹。于再灌注30、60、90、120min留取尿标本。2h后断尾取血0.5mL。再灌注至24h，取门静脉血3mL，切取双肾。HE(苏木素伊红)常规染色，光镜检查，按paller标准评分。电镜检查，免疫组化法检测iNOS表达水平。 ??? 1.3? 指标观察? ①记录再灌注后30、60、90、120min的尿量；②日立全自动生化仪检测再灌注2、24h血肌酐(Cr)、血尿素氮(BUN)浓度；③苏木精伊红染色后光学显微镜下观察其组织形态学变化；④透射电镜观察其超微结构变化；⑤免疫组化法(Envision二步法)检测iNOS的表达水平，iNOS阳性反应结果为胞浆及胞核中有棕黄色颗粒。高倍镜下(×400)每片随机取5个视野，每个视野计100细胞，计算阳性细胞数。阳性细胞数为0记作(-)，阳性细胞数25%为(+)，25%-50%为()，50%-75%为()，75%为()，并将反应强度依次评为0-4，求±s。 ??? 1.4? 统计分析? 采用SPSS统计软件进行统计学分析，数据以均数±标准差(±s)表示。定量数据先行正态性检验(u检验)，再进行方差齐性检验，组间比较用StudentNewmanKeul法。组织学评价采用Wilcoxon法。P0.05为差异有统计学意义。 ??? 2? 结??? 果 ??? 2.1? 尿量变化? 再灌注60min对照组尿量开始明显增加，60、90、120min分别与假手术组比较差异有显著性(P0.05)。甘氨酸治疗组再灌注30min尿量开始明显增加，30、60、90min与对照组比较差异有显著性(P0.05，表1)。表1? 大鼠急性缺血后尿量(mL)的变化与B组比较#P0.05, *P0.01 ??? 2.2? 再灌注2、24h血肌酐、尿素氮浓度变化? 2h血尿素氮及肌酐浓度对照组高于假手术组，差异有显著性(P0.05)，而2h甘氨酸治疗组血肌酐低于对照组，尿素氮高于对照组，差异均有显著性(P0.05)。24h血肌酐、尿素氮浓度对照组高于假手术组，甘氨酸治疗组低于对照组，差异均有显著性(P0.05，表2)。表2? 大鼠急性缺血后血肌酐、尿素氮变化与B比较#P0.05, *P0.01 ??? 2.3? 肾组织病理学检查? 假手术组大鼠肾脏HE染色未发现明显的形态学改变。光镜下对照组近曲小管上皮细胞空泡变性和坏死，肾小管腔扩张并可见管型和细胞坏死脱落，累及近曲小管所有细胞；可见明显管周血管的扩张淤血，间质中性粒细胞浸润。甘氨酸治疗组近曲小管上皮细胞部分肿胀、颗粒变性和小空泡变性，罕见细胞坏死和管型。Pallet评分甘氨酸治疗组低于对照组。 ??? 2.4? 肾组织透射电镜检查? 对照组线粒体明显肿胀变形，细胞内排列不齐，嵴稀疏断裂，有的失去正常内部结构而成为均匀-团，基底褶及刷状缘微绒毛减少消失，细胞浆内变性严重，区域溶酶体增多，粗面内质网扩张成大小不一的囊泡。甘氨酸治疗组线粒体轻度肿胀，嵴损伤较轻，细胞内排列整齐，细胞基部可见质膜反褶，细胞游离缘微绒毛丰富，个别细胞溶酶体略多，内质网和高尔基体轻度扩张或正常。 ??? 2.5? 肾组织iNOS蛋白表达水平? iNOS表达细胞在胞质或胞核中着色，呈弥漫性或棕黄色颗粒。对照组与假手术组相比iNOS表达明显增加，而甘氨酸治疗组iNOS表达明显低于对照组。采用高倍视野记数法结果显示对照组iNOS蛋白免疫反应强度明显高于假手术组，而甘氨酸治疗组iNOS蛋白免疫反应强度明显低于对照组。 ??? 3? 讨??? 论 ??? 甘氨酸是人体内最简