脱细胞半月板支架与骨髓基质干细胞联合培养研究.pdf

一 一 一～中一一文一 壅匮一 脱细胞半月板支架与骨髓基质干细胞联合培养的研究 实验目的 半月板软骨缺损的治疗一直是困扰医学界的一大难题。目前的主要治 疗手段是行半月板切除术和部分切除术，远期常并发膝关节退行性变。随 着组织工程的发展，试图用组织工程化的半月板来修复损伤。三维支架与 种子细胞是组织工程的重要因素。本实验在前人的基础上，对半月板软骨 进行脱细胞处理，制备支架，并与骨髓基质干细胞进行联合培养研究，以期 将来可以实现组织工程化膝关节的制造。 实验材料与方法 1．骨髓基质干细胞的培养 取日本大耳白兔一只(雌雄不限)麻醉后在股骨上部干骺端钻孔，抽取 骨髓，无菌接种到培养瓶中。加入含胎牛血清的低糖DMEM培养基培养。 传至第三代作为种子细胞。 2．猪半月板软骨脱细胞支架的制备 x 取猪(三月龄)半月板和膝关节软骨修整成llcm大小的片状，用 片放人内含啊s—Hcl(PH7．4)缓冲液中，4℃下保存备用。 3．兔骨髓基质干细胞与猪半月板软骨脱细胞支架联合培养 无菌条件下，收集第三代骨髓基质干细胞，以反复滴定法将细胞种植于 半月板软骨脱细胞支架中，在37℃，5％co：，饱和湿度条件下联合培养，其 后隔日换液。培养7天后观察。 4．组织学检查 培养至第三代细胞长满瓶底后，用PBs冲洗三遍，换用无血清培养基 培养三天，取培养液进行细胞培养液明胶酶谱分析，用无血清培养液作对 ·1· 比，观察其中是否含有基质金属蛋白酶2(MMP2)。分别取正常与脱细胞后 的半月板，4％多聚甲醛固定，常靓石蜡包埋，切片后进行HE染色，改良 MASSON染色。分别取脱细胞后的半月板和复合培养的半月板，2．5％戊二 醛固定，作扫描电镜观察。 实验结果 1．干细胞无血清培养液出现一条负染条带即MMP2带。无血清培养 液无负染带。 2．HE染色可见脱细胞半月板软骨内无细胞成分，基质问空隙较大，且 相互连接成网状结构。改良MASSON法染色可见脱细胞后半月板软骨基 质为绿染，证明留存有大量胶原。 3．电镜下可见脱细胞后的半月板软骨支架的孔隙大，孔隙壁不光滑， 孔隙直径20～200斗m，孔隙率为80％以上，且孔隙和孔隙之间相互连通， 形成三维网架结构。可见与半月板支架结合良好的骨髓基质干细胞，细胞 与支架紧密结合，且伸出伪足，分泌蛋白。细胞数量较多，长势良好。 实验结论 I．MMP2在骨髓基质干细胞无血清培养液中有表达，证明培养的骨髓 基质干细胞有侵袭性，可以和组织工程中的支架材料良好的结合和生长。 2．脱细胞半月板软骨支架是半月板软骨组织工程的理想支架材料。 3．单纯脱细胞关节软骨支架不符合软骨组织工程对于支架材料的要 求。 关键词 兔骨髓基质干细胞；猪脱细胞半月板软骨支架；MMPl2；联合培养 ·2· ～ 一一英～一文一 延一摘一～要一 onunited The cultureofacellularmeniscusfhmework study andbonemaHow stIDmalstemcells Objective The协jatmentofmeni8cus defectisa dimcult inmedi— canilage problem cine．Actualtreatmentmeansare and