人破骨细胞形成抑制因子骨保护素基因克隆、重组表达和初步生物学活性研究.pdfVIP

张弛:OCIF/OPG基因的克隆、表达和活性 人破骨细胞形成抑制因子/骨保护素基因克隆、重组表达 和初步的生物学活性研究 中文摘要 从培养的人肝细胞抽提总RNA，用RTPCR方法扩增得到人破骨细胞形成抑 制因子(OsteoclastogenesisInhibitoryfactor,OCIF)，或称骨保护素(osteoprotegerin, OPG)成熟肤编码基因序列。RT-PCR所得产物与pMD18-T连接，转化大肠杆菌 K802,筛选得到阳性重组克隆载体pMD18-OCIFm，对所获得的含OCIF/OPG活性 结构域编码的重组质粒进行DNA序列分析，结果与GenBank报道序列完全一致。 双酶切重组克隆质粒pUD18-OCIFm，得到OCIF/OPG成熟肚基因，将其定向插入 同样双酶切的pProEX-HTa载体中，转化大肠杆菌BL21(DE3)e筛选得到阳性重 组表达子后，用IPTG诱导表达。所表达的产物经SDS分析可见在相对分子 量 80kD 处出现一条新条带，与预期 OCIF/OPG融合蛋白的分子量一致。用 OCIF/OPG特异性一抗行WesternBlot，证实重组表达产物能与其特异性结合。以 Ni亲和层析柱初步纯化的表达产物，能诱导体外培养的小鼠破骨细胞凋亡，并呈 齐J量依赖性。 应用StratageneBacterioMatchtwohybridsystem，以pTRG构建编码TRAM.细 胞外可溶性区域序列融合表达表达质粒;以pBT构建编码DR4,DR5,OCIF/OPG 等的细胞外区域序列融合表达质粒。重组质粒分别相应共转化报告菌株XLl-Blue MRF，报道基因产物以抗梭书青霉素和尽半乳糖昔酶活性作为转录激活的指标。 所构建的pTRG-TRAIL与pBTDR4,pTRG-TRAM.与pBT-DR5及对照组分别共转 化后在高浓度狡节青霉素(500pg/ml)筛选下宿主菌呈转录激活状态，pTRG-TRAIL 与pBT-OPG组共转化后在低浓度梭爷青霉素(250pg/ml)筛选下宿主菌呈转录激 活状态，用X-Gal-PETG平皿可以进一步验证阳性克隆。对照组pTRG-TRAIL与 pBT-LGF2,pBTDR4与pTRG-Galll，pBT-DR5与pTRG-Galll或pBT-OPG与 pTRG-Galll四组共转化后呈阴性。由此直接证实了OCIF/OPG与TRAIL能直接结 合，但亲和力较TRAIL与DR4,DR5要小。另外，由于所用的双杂交序列皆为编 码这些蛋白质的细胞外区域，而这些蛋白质本身的相互作用已有其他报道验证，所 以证实了细菌双杂交系统可以用于细胞外蛋白质的相互作用研究。OCIF/OPG与 张弛:OCIF/OPG基因的克隆、表达和活性 TRAIL的相互作用，在用 OCIF/OPG重组表达产物中和 TRAIL诱导人胰腺癌 SW1990细胞凋亡的活性中也被证实。 本课题成功获得了人OCIF/OPG成熟肤基因，并实现了在大肠杆菌中的重组融 合表达;OCIF/OPG可与TRAIL直接相互作用，但亲和力较TRAIL与DR4,DR5 要低;重组表达的OCIF/OPG可诱导成骨细胞凋亡，并能抑制TRAIL对肿瘤细胞 的细胞毒效应，由此建立了初步的OCIF/OPG蛋白的生物学活性测定方法，为进一 步的研究莫定了基础。 关键词:破骨细胞形成抑制因子/骨保护素;重组表达:生物活性;肿瘤坏死因子 相关凋亡诱导配体碉亡素2配体;细菌双杂交系统:凋亡 张弛:OCJF/OPG基因的克隆、表达和活性 Cloning,RecombinantExpressionandelementarybiological activityofHumanOsteoclastogenesisInhibitoryFactor/ Osteoprotegerin Abstract UsinghumanlivercelltotolRNAasatemplate,humanosteoclastogenesisinhibitory factor(OCIF)/osteoprotegerin(OPG)maturepeptidegenewasamplifi