应用单抗夹心ELISA检测伪狂犬病毒和胸膜肺炎放线杆菌毒素ⅢA在巴斯德毕赤酵母中的表达及检测方法研究.pdf

华中农业大学硕士研究生论文 摘要 本论文包含2个部分。 PR)是由伪狂犬病病毒(PscudorabicsVkus，PrV)引起的包括家畜和多种野生动物 的一种以发热、奇痒及脑脊髓炎为症状的重要传染病。该病给养猪业造成了巨大的 经济损失，猪是本病毒的天然宿主和贮存者。准确、及时地检测出病原是防止疾病 扩散的重要措施之一。单克隆抗体的各种诊断方法在其它疾病的检测中得到广泛的 应用，显示出灵敏性高、特异性强等优点。应用单克隆抗体来检测PrV在我国报道 较少，为了能从感染PrV的动物体内和肉食品中检测出病原，本课题开展了以下研 究。 为!：100x212。这两株单克隆抗体为病毒抗原的诊断研究提供良好的材料。 1．2用纯化的病毒免疫健康猪，制备了抗PrV血清，提纯了IgG；将效价较高 的一株单克隆抗体和抗血清IgG分别作为捕获抗体和检测抗体，用于建立检测PrV 的双抗体夹心间接EUSA方法，并优化了反应条件，检测结果显示，该方法对PrV 内变异系数较小，介于为4．87％和1．07％之间。应用本方法对人工感染PrV的40日 龄仔猪组织进行检测，肺和脑PrY抗原检出率最高，其次是脾、心、肝和肌肉。应 用该方法和PCR对159份临床病料进行平行检测，二者的符合率可达到77．4％。实 验结果表明：双抗体夹心间接ELISA方法具有敏感性高、特异性强和重复性好的特 点，可应用于发病动物组织中Prv检测。 1．3从武汉市及其周边地区市场收集97头份猪肉样本、57头份羊肉样本、50 头份牛肉样本，应用双抗体夹心ELISA和聚合酶链式反应(PCR)方法平行检测样 本中的伪狂犬病毒。检测结果显示：97头份猪肉样中，双抗体夹心ELISA方法PrV PCR阳性2份(4％)；羊样本中两种方法均为阴性。这2种方法均为阳性和阴性的 分离也为阳性。 2猪传染性胸膜肺炎毒素Ⅲ在巴斯德毕赤酵母中的表达和应用 胸膜肺炎放线 华中农业大学硕士研究生论文 强的细胞毒性，抗毒素抗体的检测有助于疾病的检测或评价用含灭活毒素成分疫苗 的免疫效果。重组蛋白的应用，克服了天然蛋白纯化的困难性，建立的检测方法更 具有特异性。与其它表达系统相比，酵母表达系统具有独特的优点。为此，我们开 展了Apxm基因在毕赤巴斯德酵母中表达和应用研究。 应用PCR方法扩增猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus plcuropncumoniae， hpp)编码毒素Ⅲ结构蛋白的全长基因，连接到载体pMD．18．T中，酶切后连接到表 达载体pPICgk上，转化GSll5酵母感受态细胞，经甲醇诱导表达了分泌到胞外 kD，与预期相符。Dot．blot ApxlII蛋白。SDS分析表明。表达的蛋白大小约为110 结果表明表达蛋白与猪抗APP血清有良好的反应性。以表达产物为抗原包被微量反 应板，通过方阵滴定确定最佳抗原浓度(1：64)和血清稀释度(1：40)，建立了检 测抗胸膜肺炎放线杆菌ApxⅢ抗体的间接酶联免疫吸附试验(I．ELISA)方法。特 异性实验表明，该方法与副猪嗜血杆菌和巴氏杆菌等分类相近细菌和其它病毒如猪 伪狂犬病毒、猪呼吸与繁殖障碍综合症病毒等阳性血清均无交叉反应：重复实验表 明，批间变异系数在8．24％和2．46％之间。应用该方法和间接血凝试验(瑁陵)对 复性好的特点，可应用于临床血清中毒素Ⅲ抗体检测。 关键词：单克隆抗体；双抗体夹心ELISA；猪伪狂犬病毒Ea株：PCR：胸膜肺炎 放线杆菌：ApxIIIA基因；毕赤酵母；酶联免疫吸附试验 2 华中农业大学硕士研究生论文 Abstract Thisthesis consistedoftwo parts． 1 ofmonoclonal ELISAfor Development