经隐丹参酮诱导MSCs与控释GDNF联合移植治疗猴急性脊髓损伤实验研究.pdfVIP

经隐丹参酮诱导的MSCs与控释GDNF联合移植治疗猴急性脊髓损伤的实验研究 摘要 经隐丹参酮诱导的MSCs与控释GDNF联合移 植治疗猴急性脊髓损伤的实验研究 专 业：病理学与病理生理学 硕士研究生：刘晓刚 导 师：邓宇斌教授 中山大学基础医学院病理生理学教研室广州(510080) 摘 要 脊髓损伤(spinal 疗方法，其致残率高，严重危害着人民的健康。脊髓损伤后治疗效果差的主要原 因是神经细胞的再生与局部神经功能环路联系的恢复困难。寻找新的细胞替代死 亡神经细胞或抢救尚未死亡的神经细胞，以达到SCI后功能重建的目的，这是当 前临床治疗与研究的重点。 目前的观点已经突破了神经细胞不可再生的束缚，神经干细胞具有自我更新 能力，并且可以分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。但是，神经干细 胞仅存在于中枢神经系统很有限的部位；同时，从活体组织获取神经干细胞比较 困难，异体移植存在免疫排斥反应。因此，寻找合适的供体细胞具有十分重要的 意义。 stem cells，MSCs)是一种不同于造血干细 骨髓间质干细胞(mesenchymal 胞的中胚层早期前体细胞，具有成骨、成脂肪的分化能力，并且在特定的诱导条 件下具有跨胚层分化的能力。MSCs体内来源广泛，获取比较容易，体外扩增能 力强，可通过多种途径进行细胞移植，自体移植不存在免疫排斥反应，由于主要 组织相容性复合物II类抗原和共刺激分子表达缺陷，在异体移植治疗方面也具 有良好的前景。近年国内外研究表明，MSCs可以分化为神经细胞，这为脊髓损 伤的治疗开辟了～条新的途径。 Ⅱ 经隐丹参酬诱导的MSCs与控释GDNF联合移植治疗猴急性脊髓损伤的实验研究 摘要 脊髓损伤后由于局部组织缺乏营养性和导向性物质以及存在抑止性因素而 缺乏再生能力，并且严重限制了移植细胞的功能发挥。因此建立起适宜的微环境 factors，NTFs)是一类靶源性 同样显得非常重要。神经营养因子(Neurotrophic 神经营养物质，可以促进移植细胞的存活，参与受损后神经元的修复，影响神经 细胞的分化。NTFs已成为生命科学的研究热点之一，极大的促进了细胞移植领 域的发展。 本研究在体外建立猕猴MSCs培养体系，采用隐丹参酮体外诱导MSCs向神 经元方向分化，并检测分化过程中的凋亡；利用生物相容性材料制成胶质细胞源 cellline-derived factor，GDNF)的控释载体； 性神经营养因子(glial neurotrophie 建立猕猴急性脊髓损伤模型，并将经隐丹参酮诱导的MSCs与控释GDNF联合 移植到损伤脊髓局部进行治疗：在脊髓损伤前后的不同阶段进行电生理检测，评 定脊髓感觉和运动传导功能恢复状况；运用Tarlov评分法对猴下肢的运动功能 进行评定；运用苏木精一伊红染色观察脊髓大体结构并观察生物材料降解情况； 运用尼氏染色观察治疗对损伤脊髓前角运动神经元和后角感觉运动神经元的保 护作用：运用甘氨酸银浸镀法及图象分析系统观察脊髓白质纤维束的修复情况： 运用免疫双标方法分析移植细胞的存活与分化情况，综合以上措施评价MSCs 源性神经元性细胞与控释GDNF对猴急性脊髓损伤的治疗作用，为脊髓损伤的 治疗提供理论基础与实验依据。 本课题的研究内容包括以下三部分： 一．猴骨髓间质干细胞的分离、扩增与鉴定 1．方法 抽取猴骨髓，提取单核细胞层细胞培养，借助MSCs的贴壁特性，反复换 液、弃悬浮细胞，逐步获得纯化猴骨髓MSCs。观察细胞形态，对培养细胞进行 成脂、成骨、成神经元样细胞诱导分化，并分别进行油红O染色，Vonkossa染 色、NSE免疫组化染色。在隐丹参酮诱导MSCs分为神经元样