微流体斑点免疫芯片检测植物病毒研究.pdfVIP

微流控芯片实验室进展 微流体警点免疫芯片检测植物病毒研夸o／ 田世民1’3王岭1邹明强1’3·周朋2’3薛强1’3 。 李锦丰1’3齐小花1’3王楠1’3金泳1’3 北京中美检科微技术研究所，北京100025 关键词：微流体芯片；斑点酶联免疫：植物病毒 微流体芯片技术集微机电加工、材料科学、工业自动化控制和生物等学科综合交叉，可 在一个小的区间内完成对样品的分离、反应、试剂流入和流出等实验过程，有望实现对检测 样品的快速、高通量和自动化操作。 马铃薯A病毒(PVA)是危害马铃薯的重要病害，是我国重要的对外检疫性植物病毒。 与微流体芯片结合，进行PVA检测研究。 1材料与方法 1．1材料与试剂：PVA抗体IgG、检测抗体和磷酸氧化酶标抗体以及阳性样品(接种发 病的马铃薯叶片)和阴性对照(健康的马铃薯叶片)由本研究室提供。BSA购自Sigma公 司，BCIP／NBT购自Madison，WI。 1．2微流体装置：微流体装置样机(Fig．2)由北京中美检科微技术研究所(中国检科院 上电脑。芯片为聚苯乙烯经注塑加工而成，上设6个储液池、1个洗液池、1个废液池、6 个缓液池和6个检测通道，以及多个微泵／微阀等。每个检测通道可放入一条由8个Nc圆 片联成的NC条，每个圆片作为一个样品点，共计48个。NC条经人为插入通道内。 1．3实验操作程序：芯片上的ELISA采用复合式双抗体夹心方式，操作程序为：插入 Nc条并进行抗体包被、封闭、加样、检测抗体和酶标抗体(1：1预先混合)，每步反应30mim 性对照比较，显色者判为阳性，不显色判为阴性。加样时将NC条取出，点样(1Q【，／NC圆 片)后稍至晾干，再放回通道，除此之外，反应均在通道内进行。反应试剂和PBST分别放 在对应的储液池和洗液池内；废液流入废液池中。液体流入、流出和停留时间由微泵＼微阀和 程序控制，整个反应可在200rain内完成。 2结果与讨论：马铃薯A病毒的检测结果如Fig．3显示，在芯片的同一通道以及不同通道的 样品点间，P+均显色明显，P．无色且背景干净；不同抗体使用浓度间的显色程度亦有明显差 异，显示出一定的定量检测趋势。 ． 经多次试验表明，该微流体．斑点ELISA系统运行稳定，重复性好。与通常的Dot-ELISA 及酶标板ELISA相比，该检测系统具有节省时间、节省试剂用量(相当于4uL抗体稀释液 ／NC片，luL样品提取液／NC片)、自动化程度高、可极大地减少人为操作误差等优点。但 是，检测参数(如孵育时间，抗体浓度，缓液次数等)还有待进一步优化，以提高检测灵敏 度。 ’通讯联系人：邹明强 ， 基金项目：科研院所社会公益研究专项(No．2005DIA2J128)；国家质检总局科研计划项目(No．2005IK0073) 芯H艇用 a) {b) ……^…_m 昏 甚 r。孓 兰旦 一鎏燮