酵母葡聚糖硫酸酯制备及抗凝血活性.docVIP

酵母葡聚糖硫酸酯的制备及抗凝血活性 摘 要：利用浓硫酸-正丁醇法对酵母葡聚糖进行硫酸酯化修饰，制得多种酵母葡聚糖硫酸酯，其取代度在0.232~0.418之间。选择取代度为0.418的产物进行结构和抗凝血活性分析，该产物相对分子量为1.68×105，IR和1H NMR图谱显示该产物引入了硫酸基团；抗凝血活性测试结构表明，一定浓度的酵母葡聚糖硫酸酯可显著延长全血凝血时间和血浆凝结时间。 关键词：酵母葡聚糖；硫酸酯化；制备；抗凝血 Preparation and Anticoagulation Activity of Yeast Glucan Sulfate Abstact: Various yeast glucan sulfates were synthesized by sulfate yeast glucan in a reaction system composed of sulfuric acid and n- butanol. Their sulfate substitute degree are varied in the range of 0.232 to 0.418. The product 酵母葡聚糖硫酸酯的制备及抗凝血活性 酵母葡聚糖是酵母细胞壁的一种以β- （1，3）糖 苷键连接为主，含有少量 β- （1，6）糖苷键连接的分枝 的高分子多糖，其独特的三股螺旋紧密三维结构使其 具有增强机体免疫活性的功能，在保健食品中已作为 功能性配料使用 [1] 。 酵母葡聚糖的水不溶性限制其应用 范围，羧甲基化衍生物可克服酵母葡聚糖的水不溶性 的缺点，且因其具有提高皮肤细胞免疫活性作用而逐 渐成为高档护肤品中抗衰老抗皱的功能成分 [2- 3] 。 除了 羧甲基化修饰，多糖链中单糖分子上的某些羟基以硫 酸根所取代的硫酸酯化修饰也是增加水溶性的常用手 段，而且硫酸酯多糖常具多种生物活性，如抗病毒、抗 菌，有良好的血液相容性和抗凝血等生物活性 [4- 7] 。天然 多糖衍生物一般没有细胞毒性，将酵母葡聚糖硫酸酯 化 修 饰 合 成 酵 母 葡 聚 糖 硫 酸 酯 （Glucan sulfate, S- glucan ），在保留免疫活性基础上，可改善水溶性，其 所具有特殊生理活性，将可开发出适合特殊需求人群 的功能性保健食品 。 硫酸酯化的方法常用的有：氯磺酸一吡啶（甲酰 胺）法 、浓硫酸法等 [8] ，前者得率高 、硫酸基团取代度大， 但采用氯磺酸等剧毒试剂。浓硫酸法虽然产物的取代 度稍低，而高取代度并不代表高活性，而且高取代度往 往严重破坏酵母葡聚糖原有的三维结构，对保持免疫 活性是不利的。本实验采用浓硫酸- 正丁醇法，制备酵 母葡聚糖硫酸酯，测定其硫酸基团取代度和分子量，用 红外光谱及 1 H NMR进行结构分析鉴定, 并初步分析其 抗凝血活性 。 1 材料与方法 1.1 材料与仪器 酵母葡聚糖和羧甲基酵母葡聚糖 [3] ：广东药学院 生物化学实验室制备；健康人枸橼酸化血浆：购自广东 武警医院；类凝血酶Agacutin：昆明龙津药业有限公司 提供；其余试剂均为国产分析纯试剂。 ALPHA1- 4 型真空冷冻干燥机：德国CHRTST公 司； Nexus670型红外光谱仪：美国Thermo Nicolet公司； 515- 410型凝胶渗透仪：美国Waters公司；Mercury- Plus 300核磁共振波谱仪：美国 VARIAN公司。 1.2 方法 1.2.1 酵母葡聚糖硫酸酯的制备 参考 [9] 方法，分别量取一定量的浓硫酸、正丁醇， 置于带干燥管和搅拌装置的三颈瓶中，搅拌，冰浴冷却 至- 5 ℃，缓慢加入200 目的酵母葡聚糖粉末5 g。反应 温度对于以浓硫酸为酯化剂的酯化反应很重要，超 过 0 ℃ ，则多糖的酸水解作用明显。试验中保持反应温 度- 5 ℃，反应一定时间后，反应体系用NaOH中和，离 心，蒸馏水透析24 h，减压浓缩至20 mL左右，加入体积 分数 95 %乙醇，静置后离心，收集沉淀物，将沉淀物溶 解于水，再透析24 h，透析液经冷冻干燥后得S- glucan。 1.2.2 纯度鉴定及相对分子量测定 应用美国Waters 515- 410凝胶渗透仪测定硫酸酯 化产物的相对分子量。 1.2.3 硫酸基含量测定 [10] 采用 BaCl 2 - 明胶浊度法，S- glucan中硫酸基含量用 取代度（degree ofsulfur，DS）来表示。DS是指S- glucan上 每个葡萄糖残基中含有的硫酸基团的平均个数。取代 度计算公式： DS=（1.62×S %）（/32- 1.02×S %），式 中S %为硫酸基的百分含量。 1.2.4 红外光谱分析 KBr 压片，采用Nicolet 670 FT- IR（Ther