毛蚶天然多肽提取纯化及其体外抗氧化能力和抑制肿瘤活性的初步研究.pdfVIP

毛蚶天然多肽提取纯化及其体外抗氧化能力和抑制肿瘤活性的初步研究 I 毛蚶天然多肽提取纯化及其体外抗氧化能力和抑制肿瘤活性的初步研究 II 毛蚶天然多肽提取纯化及其体外抗氧化能力和抑制肿瘤活性的初步研究 III 毛蚶天然多肽提取纯化及其体外抗氧化能力和抑制肿瘤活性的初步研究 IV 毛蚶天然多肽提取纯化及其体外抗氧化能力和抑制肿瘤活性的初步研究 毛蚶天然多肽提取纯化及其体外抗氧化能力和抑制肿瘤活 性的初步研究 摘 要 毛蚶是我国重要海产经济贝类，其肉质鲜嫩、营养全面且具有一定的药用功 效。目前罕见对毛蚶肉中的天然生物活性成分的研究，因此对其中天然存在的活 性物质的提取及应用做出讨论，将为毛蚶的高值化利用提供基础和途径，并对挖 掘其药用前景具有十分重要的意义。本论文以新鲜毛蚶肉为原料，对毛蚶肉中的 天然多肽、蛋白，利用缓冲液浸提、硫酸铵梯度盐析得到毛蚶蛋白粗提物，再经 过超滤和凝胶层析系统进一步分离纯化，得到三组不同分子量段的毛蚶天然多肽。 分别采用高效液相色谱法和 Tricine-SDS电泳技术分析鉴定所得到的三组 活性多肽的组成和分子量分布。最后对三组毛蚶多肽的体外抗氧化活性和抑制肿 瘤细胞增殖能力做出了初步研究。 首先，进行了毛蚶肉中抗氧化活性蛋白提取的单因素试验。蛋白提取环境为 磷酸盐缓冲液体系（PBS ），考察了三个因素：PBS 缓冲液的 pH 值、缓冲液中 NaCl 浓度、料液比对毛蚶蛋白提取率和 O2- ·、DPPH·自由基清除率的影响。通 过单因素实验，确定最适提取条件是pH 为7.0、NaCl 浓度为0.05 mol/L、料液 比为1:2。 其次，采用盐析法和超滤技术对毛蚶蛋白粗提物进行分级分离，并运用 Sephadex G- 15 凝胶层析进行脱盐纯化。盐析结果表明，30~100%饱和度硫酸铵 盐析下的提取物复溶性较好，且抗氧化活性较高。对此饱和度沉淀物复溶后通过 截留分子量分别为30 kD、10 kD、3 kD 的超滤膜，收集分子量段分别为Mw 3 kD、3 kD Mw 10 kD、10 kD Mw 30 kD 的毛蚶多肽。运用Sephadex G- 15 凝胶层析柱对三组毛蚶多肽脱盐纯化，收集的洗脱峰溶液经冷冻干燥后得到毛蚶 天然肽干粉：组分1 （0~3 kD ）、组分2 （3~10 kD ）、组分3 （10~30 kD）。 分别运用高效液相色谱法和 Tricine-SDS电泳技术对三组毛蚶多肽组 分进行分子量分布的测定。HPLC 实验结果表明：组分 1 的多肽由五部分组成， 其分子量分布为440.59 Da 、721.98 Da 、1252.45 Da 、1734.17 Da 、3158.68 Da ； 组分2 中主要由4 部分组成，分子量分别约为4776.48 Da 、5831.68 Da 、7478.94 V 毛蚶天然多肽提取纯化及其体外抗氧化能力和抑制肿瘤活性的初步研究 Da 、9454.88 Da 。电泳结果表明，组分3 中的蛋白质分子量较小，范围在10~20 kDa 。 最后，对纯化的三组毛蚶天然多肽进行了体外抗氧化活性和抑制肿瘤细胞增 殖能力的初步探究。实验结果显示，组分 1 对超氧阴离子自由基和 DPPH·自由 基的清除作用最好，样品浓度5.00 mg/mL 时对两种自由基清除率分别达40.54%、 28.66% 。MTT 实验结果显示：组分1 对肝癌细胞HepG2 增殖具有一定的抑制作 用；组分2 对肝癌细胞HepG2 增殖存在潜在的促进作用，但必须达到特定浓度； 组分3 对肝癌细胞HepG2 增殖没有明显影响。体外活性探究结果发现，毛蚶中 提纯的分子量小于3 kD 的天然寡肽兼具良好的抗氧化活性和抗肿瘤活性，具有 进一步开发的价值和意义，以及开发成新型海洋天然药物的潜力。 综上