产细菌素乳酸菌筛选及其纯化和稳定性研究.pptVIP

产细菌素乳酸菌的筛选及其纯化和稳定性研究 陈　沛，王雪青，阮海华 天津师范大学学报，2011,32（2）：82-85 试验方法与讨论 材料 产细菌素乳酸菌株的分离 生物学特性选育 细菌素的热稳定性 细菌素的酸碱稳定性 细菌素对胰蛋白酶的敏感性 细菌素在不同pH条件下的热稳定性 结论 试验方法与讨论 材料 实验菌种：大肠杆菌（Escherichia coli）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、藤黄微球菌 （Micrococcus luteus）、单增李斯特菌（Listera）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、志贺氏菌（Shigella）、沙门氏菌（Salmonella），均来自天津商业大学微生物教研室． 培养基：MRS培养基、LB培养基、CM502培养基，溴甲酚紫MRS鉴定培养基． 产细菌素乳酸菌株的分离 抑菌试验 菌种复筛 生物学特性选育 细菌素的热稳定性 细菌素的酸碱稳定性 细菌素在不同pH条件下的热稳定性 　细菌素对胰蛋白酶的敏感性 结论 * * 细菌素（Bacteriocin）是由某些细菌在代谢过程中产生的一类具有抑菌作用的蛋白质或多肽，常表现为对同种或近源菌种有特异性的抑制作用。 乳酸菌指发酵糖类主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸的细菌统称为乳酸菌。 （革兰氏阳性球菌，短链．在MRS平板上生长呈圆形、直径约1.2mm、乳白色、低凸起、边缘整齐、不透明的光滑型菌落。) 乳酸菌在利用乳糖或葡萄糖的代谢过程中，伴随乳酸酵，可产生很多物质，如有机酸、过氧化氢和细菌素等，具有抑制腐败菌生长的特点，是健康人和动物肠道的优势菌群之一，对于维持肠道微环境的稳定与健康发挥着重要的作用。肠内乳酸菌种植种群与健康长寿有着非常密切关系。乳酸细菌素抑菌谱与产生菌密切相关，现已发现的乳酸菌细菌素有40余种，但广泛应用的只有乳酸链球菌素（Nisin），因此研发具有广谱抗菌作用的新型乳酸菌细菌素具有十分重要的意义。婴儿粪便中的乳酸菌，与其他材料相比无论是在数量还是种属上，都占据十分重要的优势地位。 菌种初筛 将采集到的婴儿粪便用生理盐水进行10倍递增稀释，得到稀释度分别为10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6的样品，并将其均匀地涂布于含有0.02g/ml CaCO3的MRS平板上，于30℃培养48h，挑取有溶 钙圈的单菌落于含有溴甲酚紫的MRS培养基划线分离，反复纯化．挑取单菌落进行革兰氏染色，镜检，观察乳酸菌的形态及颜色是否一致。 采用牛津杯法进行筛选 按体积分数1%接种 30℃，48h 连续培养3代 离心（4℃，15min） 上清用0.22μm滤膜过滤,滤液用1M NaOH调节pH7.0 指示菌培养液 OD600=0.1 取100μL涂布 LB培养基（李斯特菌涂布于CM502培养基） 乳酸菌 5mL MRS培养基 复筛 连续培养3代 60%硫酸铵沉淀 液体MRS培养基培养 离心，过滤 高速离心 沉淀乙酸钠复溶 过Hitrap SP HP(GE)阳离子交换柱 抑菌试验(F-6-B) 以金黄色葡萄球菌为指示菌，以未经处理的发酵液为阳性对照，MRS培养基为空白对照，以抑菌圈直径的大小反映该细菌素的酸碱稳定性 将发酵液用HCL和NaOH调节到不同的pH值，于25℃处理2h，金黄色葡萄球菌为指示菌，MRS培养基为空白对照，以抑菌圈直径的大小反映该细菌素的酸碱稳定性。 将F-6-B菌株发酵离心上清液分别调至不同的pH值，然后在不同的温度下处理不同的时间，最后回调至中性环境，以未经处理的原液作为对照，检测抑菌活性。 用5mg/ml胰蛋白酶对发酵液处理2h，MRS培养为空白对照，以抑菌圈直径的大小反映该细菌素对胰蛋白酶的敏感性。 利用从30个健康婴儿中分离得到的一株产广谱细菌素的乳酸菌（F-6-B），通过排除发酵液上清中有机酸和过氧化氢的影响，初步证明F-6-B产生的是一种细菌素，该细菌素的抑菌活性与Nisin相似。 对该乳酸菌产生的细菌素进行了初步研究，从对该细菌素的耐酸碱，热稳定以及蛋白酶敏感等实验，发现该细菌素在酸碱环境下均具有很强的抑菌作用和很好的热稳定性，即使在121 ℃ 加热15min的条件下，仍有抑菌活性，并且表现对胰蛋白酶不敏感．与目前在食品加工中广泛使用的Nisin相比，由于其较好的热稳定性