呋喃唑酮代谢物单克隆抗体制备及酶联免疫吸附分析方法 Production and Identification of Monoclonal Antibody Against Furazolidone Metabolites and Development of Enzyme-Linked Immunosorbent Assay.pdfVIP

第40卷 分析化学(FENⅪHuAxuE)研究报告 第5期 2012年5月 chinescJ0umalof 745～751 Anal州caIChemishy 呋喃唑酮代谢物单克隆抗体制备及酶联免疫吸附分析方法 任海涛 沈玉栋 徐振林 杨金易 雷红涛 肖治理 王弘 孙远明+ (广东省食品质量安全重点实验室，华南农、Jk大学食品学院，广州510642) 摘要本研究针刘呋哺唑酮代谢物(AOz、，设计合成了系列半抗原，进一步通过偶联牛血清白蛋白(BsA) 免疫Balb／c小鼠、细胞融合、筛选和亚克隆等过程成功获得了源于新颖半抗原H，的具有高亲和力(亲和力常 数6．68x10”L，m01)和高特异性(与其它功能类似物交叉反应小于O．】％)抗AOz单免隆抗体。同时，基于设计 合成的系列同／异源半抗原／包被抗原，考察了不同结构包被原对ELIsA方法灵敏度的影响。另外，采用最佳 ug／L．定 虽检测线性范围为O．14～23．6 056¨g／L。两种方法对AOz的检测灵敏度和定量线性范围均 pg几．检m限为0 达到相关检测限量要求，可满足不同需求的实际样品检测。 关键词 呋喃唑酮；单克隆抗体；酶联免疫法；异源包被 引 言 呋喃唑酮是一种硝基呋喃类药物，广泛应用于水产类和禽类养殖．其在体内代谢快速，主要以代谢 物3一氨基一2一嚼唑烷酮(Aoz)形式存在．具有一定毒性、致畸性、致癌性，对人体健康与生态平衡具有潜 在威胁“‘2】。因此，欧美等多国禁止其在动物生产叶1使用，我国农业部自2002年规定动物源性食品中呋 喃唑酮不得检出”】。 灵敏、准确，但存在前处理繁琐、操作复杂、检测成本高的问题，难以满足现场大批量样品快速检测要求。 近年来，基于抗原抗体反应的ELISA等快速免疫分析方法以其特异性强、灵敏、简便、准确和样品通量 高等优点，弥补仪器法的不足，成为农兽药残留快速筛查的热点技术方法旷目。c00per等于2004年首次 制备了呋喃唑酮代谢物的多克隆抗体．对虾组织样品中A0z的检出限为o．3¨g／L。q；¨I等报道了多克 的快速检测产品，因而开发可弥补多克隆抗体不足的单克隆抗体已成为发展趋势。Diblikova等在呋喃 唑酮代谢物单克隆抗体基础上建立J，定量检测范围达到o．05～5 ug几的ELIsA方法…l。另外，由于 A0z分子太小，难以直接检测．必须采用衍生化增加分子量方法实现间接检测p“】。本研究以对硝基苯 甲醛(p—NP)为AOz衍牛试剂，基于新设计合成的系列半抗原，制备筛选获得了高特异性、高亲和力抗 AOz单克隆抗体，并在考察了不同结构包被原对ELIsA方法灵敏度的影响基础上，采用最佳的特征结 测方法，为进一步开发可满足实际样品不同检测需求的直接和间接竞争ELISA试剂盒奠定基础。 2 实验部分 2．1仪器与试剂 20ll04 1l 29收稿；20Il30接受 本史系国家自然科学基金(No 学校长基金(No5100_K08198)资助 + E cn mail：ymsun@5cauedu 万方数据 分析化学 第40卷 冷冻离心机(Sigma公司)；xSB一1A倒置显微镜(上海精密仪器有限公司)。 胎牛血清(四季青公司)；其它化学试剂均为国产分析纯。 2．2实验方法 2．2．1 mmol 半抗原合成 半抗原合成路线如图解1所示。半抗原H，或H。：1 A0z与乙醛酸(或羧基 苯甲醛)于10 mL甲醇中室温反应2h，滤出沉淀，分别用水和甲醇清洗3次，烘干得半抗原H。(或H。)。