实验九DNA的酶切.docVIP

实验九 DNA的酶切 一、原理 1．三类限制酶 限制酶特异地结合于其识别的特殊DNA序列之内或附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。限制酶可分为3类。I类和Ⅲ类限制酶在同一蛋白质分子中兼有修饰(甲基化)作用及依赖于ATP的限制性酶切活性。Ⅲ类限制酶在识别序列上切割DNA，然后从底物上解离。而I类限制酶结合在识别序列上，但却随机地切割回转到被结合酶处DNA。 在基因工程中I类和Ⅲ类限制酶都不常用。常用的是I类限制酶。 2．Ⅱ类限制酶 Ⅱ类限制酶又可分为二种酶，一种是限制性内切酶，它切割裂一特异性的核苷酸序列；另一种为独立的甲基化酶，它使识别序列甲基化。 基因工程中常指的限制酶或限制性内切酶就是第一种I类限制酶。 3．限制性内切酶 (1)识别序列一般为回文对称型，如EcoR I识别序列为： 5’…GAATTC…3’ 3’…CTTAAG…5’ 对称轴两则等距离的碱基两条互补链识别序列完全一样。 (2)识别序列长度大多数为4～6个核苷酸。 (3)切割方式两种 A．错位切割 大多数限制性内切酶不在识别序列的对称轴上切割DNA链，而在偏离对称轴数个核甘酸处切割。 错位切割所产生的DNA末端，两条链不平齐，一条链凸出，一条链凹进，这种末端称为粘性末端(Cohesive Ends)。 带有相同粘性末端的DNA分子很容易在末端互补配对，连接成新的重组分子。 B.沿对称轴切割，一些酶在对称轴处切割，产生平齐末端(Blunt Ends)。 (4)同裂酶(同切口限制性内切酶) 一般说来，不同的限制性内切酶识别不同的序列。然而有一些从不同来源分离的酶能在相同靶序列切割。这些酶称为同裂酶(Ischizomers)。 有—些识别四核苷酸序列的酶识别序列在另一种六核苷酸识别序列之内，如MboI和Sau3A I，识别序列在BamHl之内。 两种酶切割反应要求最严的成分是底物DNA，酶要产物直接受DNA底物纯度的影响。 提取过程中的酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl均能干扰反心，有些甚至改变识别序列 两种酶切割后得到相同末端．所以这两种酶产生的片段可以连接。 (5)来源及命名 一般采用Smith和Nathans(1973)提出的方法对限制性内切酶进行命名，以产生该酶的微生物属名的第一个字母(大写)种名的前两上字母(小写)，以及菌株型号或质粒、噬菌体名称组成。例如，从Bacillus amyloliqu-faciens H中提取的性内切酶称为BamH：从Haemophilus influenzae Rd中提取的限制性内切酶成为Hand；从Escherichia ColiRT中提出的酶称为EcoR(大肠杆菌耐药质粒R1)。在同一型号细菌中的几种不同酶可以编成不同的号，如HindⅡ、HindⅢ、HpaI、HpaⅡ、MboI、MboⅡ等。 (6)限制性内切酶的星活性 一般来说，限制性内切存在严格的识别在序列特异性，但某些条件改变，会使其对识别序列特异性的放宽，而导致在DNA内产生附加切割，限制性内切酶表现的这种活性称为星活性，或第二活性，在名称右上角加一星号表示。 产生星活性的条件 ①甘油浓度 ②离子强度 高盐缓冲液酶降低盐 ③pH值 7.5～8．5产生 ④有机溶剂 DMSO(二甲亚砜)1～2%(V/V) ⑤二价阳离子Mn2+代替Mg2+ ⑥酶与DNA的比例 酶与DNA比为(50U／μg)产生星活性。为了防止星活性的出现，所有限制性内切酶反应在标准条件下(特别是pH、离子强度、二价离子浓度的条件下)进行。 某些限制性内叨酶诱导产生星活性的反应条件 酶 诱导星活性条件 AvaI A,B,D EcoRI A,B,D,E,F HaeⅢ B,D HhaI B,D,G BamHI A,B,C,D,E,H A．乙二醇(45％)；B.甘油(11～20％)；C.乙醇(12％)； D．高酶：DNA比值()25U／μg)；E．Mn2+代替Mg2+； F．pH8．5；G．DMSO(8％)；H．无NaCl 4．影响限制性内切酶反应的因素 限制性内切酶能否有效、特异地切割DNA，最关键的因素有 (1)底物DNA的纯度与物理特性 A纯度 酶切反应要求最严的成分时底物DNA，酶要产物直接受DNA底物纯度的影响。 提取过程种