急性病毒性坏死病毒分子流行病学调查及奥尔森帕金虫环介导等温扩增检测方法建立.pdf

急性病毒性坏死病毒(艄n小，)分子流行病学调查及奥尔森帕金虫环介导等温扩增检测方法的建立 急性病毒性坏死病毒(删)分子流行病学调查及奥尔森 帕金虫环介导等温扩增检测方法的建立 摘 要 栉孔扇贝(C讫肠叼疆．屈脚订)是我国北方沿海主要的贝类养殖品种之一。“急 ViralNecmsis 性病毒性坏死病毒”(Acute Vims；AⅥ虾，)经证实是一种能对栉孔扇 贝造成极大危害的病原体。本文应用PCR检测方法，对青岛流清河湾和荣成桑 沟湾养殖栉孔扇贝、养殖设施大型附着污损生物及在全国6省14个养殖海区采 集到的贝类样品进行删检测分析，以探讨AⅥW在全国的分布、可侵染宿 主、感染增值规律以及可能的传播途径。同时，建立了奥尔森帕金虫(n旆胁淞 D厶e，l‘尸D厶绷f)环介导等温扩增技术(100p-mediatcdisom黜al扰lpli6cation， LAMP)并进行应用，从而为贝类健康养殖模式的探索、提出以及建立贝类大规 模死亡的疾病防疫模式奠定理论和技术基础。 本文应用PCR方法连续一周年检测两个不同贝类养殖海区栉孔扇贝样品携 带越仆Ⅳ的情况。检测结果显示，2010年青岛流清河湾样品在8月份删阳 性检出率最高，栉孔扇贝野生苗和蓬莱红分别高达60％和30％，栉孔扇贝的 觚NV阳性检出率与栉孔扇贝大规模死亡流行病学特征具有正相关性，高温(7 月、8月和9月份海水平均温度23℃以上)可能是导致删侵染栉孔扇贝并致 其死亡的重要环境胁迫因子；桑沟湾扇贝养殖海区属于贝藻混养海区，全年栉孔 扇贝的觚仆n，阳性检出率均较低，栉孔扇贝样品的怂仆『、，阳性检出率最高时间 为2010年8月，蓬莱红、人工育苗和野生苗心M，阳性检出率分别为20％、10％ 和20％。2010年流清河扇贝养殖场野生苗和蓬莱红存活率分别为37．41％和 61．33％；桑沟湾扇贝养殖海区蓬莱红、人工育苗、野生苗存活率分别为96．67％、 92．5％、94．17％，表明贝藻混养的养殖模式与单一养殖模式相比，可以保持养殖 海区的生态环境在一个稳定可持续发展的状态，抑制筒ⅢV侵染栉孔扇贝或阻 止怂邮，的传播，从而降低栉孔扇贝发病率。 对2010．2011年青岛流清河湾与荣成桑沟湾两个不同海区养殖栉孔扇贝的扇 贝养殖设施上常见的几种大型附着污损生物进行检测，以探讨其能否携带 AⅥqV，是否为AVNV的潜在宿主，以及A、邮r传播过程中污损生物所起的作 急性病毒性坏死病毒(A、rNV)分子流行病学调查及奥尔森帕金虫环介导等温扩增检测方法的建立 用。两个养殖海区中紫贻贝、麦秆虫和长牡蛎样品均检出AVNV阳性，青岛流 清河湾养殖海区的东方缝栖蛤未检出有AⅥ叮V阳性，表明紫贻贝、麦秆虫和长 牡蛎可携带AⅥW，为AⅥ小，的宿主，东方缝栖蛤与柄海鞘未检出AⅥ呵V阳性， 可能不是A、仆『、r的宿主。 24批次390份样品，其中包括9种主要海水养殖贝类，包括双壳纲贝类7种， 腹足纲2种。使用PCR方法检测这些贝类样品越仆『、，携带情况，有5种贝类样 品可携带越—刚v，说明筒烈V在养殖贝类中宿主范围分布较广泛，包括：近江 牡蛎、长牡蛎、虾夷扇贝、翡翠贻贝和紫贻贝等；共有3种贝类样品未检测出 A=、忡，阳性，包括海湾扇贝、皱纹盘鲍和黑鲍，但是受采样地点、时间和样品数 量的限制，这些种类能否携带删还需要进一步研究。 奥尔森帕金虫(心廊凇船D西绷f，PD艮P栉f)是重要的贝类病原性寄生虫之一， 5．8SrDINA 为建立快速、准确、灵敏和使用简便的检测方法，本文根据PD厶e万f 中的内转录间隔区(缸n锄a1咖sc曲ed Spacer，ITS)序列，使用在线设计软件 Primef D艮P，lf V4设计一套P L州P引物，建立了环介导等温扩增 Explorer iso也emal (100p．mediated uL 优化，最终确立PD西e川的25L√蝴P反应体系，且最佳反应温度为64℃，最 佳反应时间为60 D西绷f5．8S