钙离子处理对肌细胞组织特异性钙激活中性蛋白酶calpain3的影响.pdfVIP

钙离子处理对肌细胞组织特异性钙激活中性蛋白酶 calpain3 的影响 1，2 1 1，2 1 1∗ 朱燕 童敏 罗欣 徐幸莲 周光宏 1 （南京农业大学农业部农产品加工重点开放实验室 210095， 2 山东农业大学食品科学与工程学院271018） 摘 要：本研究利用 RT-PCR 和 Western blot 方法研究钙离子处理对成肌细胞 L6 形态、分 化的影响以及 calpain3 基因 mRNA 水平表达和蛋白水平降解的调控。结果表明，成肌细胞 L6 的细胞分化程度随着钙离子浓度的增加而增大，且死亡细胞明显增多。RT-PCR 和 Western blot 结果表明钙离子处理后 calpain3mRNA 个样品之间的表达无明显差别，但是免疫印迹图 谱却发现，钙离子处理组与对照组相比，94kDa 处的条带颜色稍有降低，55kDa 处的条带颜 色加深，说明有更多的小片段生成，且钙离子浓度大于200μM 时 94kDa 处的条带消失。 关键词：RT-PCR L6 成肌细胞 Western blot 骨骼肌特异性钙激活中性蛋白酶，P94 是 calpain 超家族的一员，虽然其在活体中的功 能不详，但可能对骨骼肌功能的发挥起到必不可少的作用[1] （Sorimachi 2000 ）。Calpain3 蛋 白分子由四个结构域组成，这与 Calpain1 和 Calpain2 的大亚基有较高的同源性[2]。除此以 外，Calpain3 还具有 3 个特异性的结构，分别是 N-端延伸亚基（NS ）和两个插入序列：结 构域Ⅱ内的插入序列 IS 1 和结构域Ⅲ和Ⅳ之间的插入序列 IS2 ，而 IS2 与核转导信号具有相 似序列。 由于研究发现Calpain3 的mRNA 表达水平大约是 Calpain1 和 Calpain2 的十倍之多，因 而 calpain3 对于肌肉功能的作用引起人们的极大兴趣。Richard[3] （1995 ）发现 calpain3 基 因突变可以导致2A 型肌营养不良症 （LGMD2A ）的产生，从基因水平证实了起初科学家对 于 calpain3 功能的猜想。自动降解性是 Calpain3 最主要的性质[45][46],在低或无钙离子存在 的情况下 Calpain3 的半寿期（half live ）小于 10min 。迅速的自动降解性，使得人们几乎无 法在离体条件下研究 calpain3 的用，进而人们把研究方向转向对 calpain3 表达调控的研究。 有的学者利用反义 RNA 技术对 calpain3 的mRNA 干扰，导致细胞中缺乏含有弥漫α-actitin 的成熟Z 盘[4] （Poussard et al， 1996 ）。此外，研究表明大多数情况下缺乏 calpain3 的活性 会导致肌肉的病理反应[5] （Kihbara 1998 ）。 Calpain3 作为钙激活中性蛋白酶超家族一员，结构中也含有 EF 手型这种钙调控结构， 表明钙离子也可能是这种蛋白酶的一个重要的调控因子。且在钙离子对 calpain3 降解的影响 上还存在较大争议。本研究利用 L6 为研究对象，探讨钙离子处理对活体肌细胞中 calpain3 表达的影响。 1 材料与方法 1.1 成肌细胞培养、分化和 Ca2+处理 大鼠 L6 成肌细胞系 （购于中国科学院上海细胞库，源自 ATCC ）按照 1.5×105 的密度 基金项目：教育部博士点基金（20020307006 ），国家自然科学基金资助项目） 作者简介：朱燕（1974-），博士研究生，讲师，主要研究方向：肉品质量控制。*通讯作者 Corresponding author ： 周光宏(1960-)，Email:ghzhou@ -1-