山东德州驴朊病毒基因克隆与序列分析.pdfVIP

德州驴朊病毒基因克隆与序列分析1 张太翔，赵德明 中国农业大学国家动物海绵状脑病实验室，北京（100094 ） E-mail：zhaodm@ 摘 要：根据已报道正常哺乳动物朊蛋白(PrP)基因序列设计引物, 采用 PCR 法扩增了德州 驴的PrP 基因, 将其克隆到T -Vector。序列测定及分析表明所克隆的德州驴PrP 基因片段为 767bp, 该基因内无内含子, 包含了驴PRNP 完整编码区序列, 编码256 个氨基酸的前体蛋白, 推测其分子量约34ku。 通过对德州驴朊病毒核苷酸和氨基酸序列与其他7 种动物的比较， 我们发现有 3 个区域变异较大，分别与种属屏障和潜伏期有关。经推测驴的 PrP 基因型是 ARQ 型，对羊痒病中度敏感，但是至今没有马科动物感染羊痒病地报道。这为TSE 种间传 播的突破提供了基础数据。 关键词：德州驴，朊病毒基因，克隆，序列 中图分类号：S588.9 引言 传染性海绵状脑病（TSEs ）是一种可引起人和动物一系列神经退化性疾病的一种新型 传染病,包括羊瘙痒病(Scrapie)、牛海绵状脑病(BSE)、鹿的慢性消耗性疾病（CWD ），水貂 ， ， 海绵状脑病（MSE ），猫的疯猫病（FSE ），人克雅氏病(CJD)[1 2 3] 。TSEs 疾病起始于正 常的 PrPc 发生错误折叠,形成富含 β 片层的、抗蛋白酶水解的 PrPsc 。人们已经认识到 PrPc 向PrPsc 转化是疾病发生和发展的关键。错误折叠的 PrPsc 有很强的聚合倾向，先形成淀粉样 的小纤维,进一步聚合形成淀粉样斑块,最后发展为可被临床诊断的大脑海绵状退化变性病症 [4，5] 。 朊病毒种间障碍是指一个种属对另一种属的朊病毒感染具有抵抗力的现象，表现为在 PrPsc 的繁殖过程中存在朊病毒的种属特异性。种属特异性是指一个种属对另一种属产生的 朊病毒颗粒的侵染具有抗性的现象，其外在表现为潜伏期的延长甚至不发病。目前认为种属 特异性的根本原因在于组成 PrP 的氨基酸一级结构的差异，造成三维构象上的不同所引起 的。朊病毒蛋白本身并不含有核酸,它是由宿主染色体基因编码形成的。迄今已克隆了人和 25 种非人灵长类动物的朊病毒基因,推导和测定了它们的序列。PrP 基因结构和其编码蛋白 的序列是高度保守的。人、仓鼠、小鼠、绵羊、牛、水貂之间PrP 的同源性均高于 80%。已 ， 被测定的 25 种非人灵长类动物和人 PrP 基因氨基酸同源性为 92.9-99.6%[6 7] 。发生替代的位 置是对 PrP 二级和三级结构提供特殊信息的位置，其数量已足以确定遗传连锁。研究表明了 人、鼠、羊、牛、鹿的 PrP 基因多态性对朊病毒病有连锁关系，但马属动物 PRNP 多态性却 少见报道。为研究动物朊病毒病的种间屏障和致病机理，笔者开展了相关研究,对德州驴 PRNP 基因扩增并克隆测序，对所得的德州驴 PrP 基因与其他马属动物的 PrP 基因进行分析 比较。 1. 材料和方法 1.1 工具酶和试剂：pMD18-T-easy 试剂盒, Kpn 、EcoR Ⅰ等限制性内切酶及T4-DNA 连 接酶、X-gal 、IPTG、琼脂糖为Promega 公司产品。DNAMarker 、exTaq DNA 聚合酶为大连 1本课题得到国家自然基金（No）和教育部博士点基金（No.20020019006 ）资助项目 的资助。 -1- 宝生物工程公司产品。质粒纯化试剂盒(QIAprepSpinm iniprep)、DNA 回收试剂盒(Gen