响应面法优化一种新型类人胶原蛋白发酵培养基.pdfVIP

西北大学学报 (自然科学版) 2009年4月 ，第39卷第2期，Apr．，2009，Vo1．39，No．2 JournalofNorthwestUniversity(NaturalScienceEdition) · 化学与化学工程 · 响应面法优化一种新型类人胶原蛋白发酵培养基 张 驰 ，范代娣 ，米 钰 ，马晓轩 ，骆艳娥 ，薛文娇 (1．西北大学 陕西省可降解生物医用材料重点实验室／陕西省生物材料与发酵工程技术研究中心；2．西北大学 生命科学学 院，陕西 西安 710069) 摘要：目的 借助于MINITAB统计学软件，采用Plackett—Burman设计和响应面优化法对基因工程 茵EscherichiacoliBL21发酵生产类人胶原蛋 白的原始培养基进行优化研究。方法 首先利用 Plaekett-Burman设计筛选 出对类人胶原蛋白产量影响显著的3个因素，即葡萄糖甘油 1：4混合碳 源、酵母粉和硫酸铵。在此基础上用最陡爬坡实验逼近最大响应区域，找到后续实验的中心点。再 利用Box—Behnken实验设计及响应面分析法进行回归分析，确定主要影响因素的最佳水平。结果 优化后的3种主要影响成分为葡萄糖甘油1：4，混合碳源12．24 L，硫酸铵7．12g／L，酵母粉5．53 g／L。结论 方程拟合 良好，优化后的培养基发酵产量经摇瓶和发酵罐验证，产量分别为5．91 L 和6．12，s／L，较优化前分别提高了306％和296％。 关 键 词：类人胶原蛋白；重组大肠杆菌；发酵；响应面优化法 中图分类号：Q815 文献标识码 ：A 文章编号：1000-274X(2009)02-0230-07 胶原蛋白是一种广泛存在于有机体中的结构蛋 传统的培养基优化方法是改变一个变量，固定 白质，其最普遍的结构特征是三螺旋结构，由3条a 其他变量的方法来进行实验，但这种方法不仅耗时 多肽链组成，每一条胶原链都是左手螺旋构型。3 费力，而且不能反映不同变量之间的交互影响作用。 条左手螺旋链又相互缠绕成右手螺旋结构，即超螺 本研究所采用的响应面 (ResponseSurfaceMethodol— 旋结构。胶原蛋 白独特的三重螺旋结构，使其分子 ogy)分析法不仅可以大大减少工作量，而且能够充 结构非常稳定，并且具有低免疫原性和 良好的生物 分反映主要影响因素之间的交互作用对 目标产物产 相容性等特点。 量的影响，这种方法 目前已经广泛地应用于培养基 本实验所研究的胶原蛋 白作为一种新型胶原蛋 的优化 J。利用该方法对本实验室保存的基因工 白，是利用基因工程技术将人源性胶原蛋 白的 程菌EscherichiacoliBL21发酵生产类人胶原蛋 白进 mRNA逆转录生成 cDNA，再经过酶切修饰后进行特 行培养基成分的优化，并在 12．8L发酵罐 中进行了 定序列重复，转化于大肠杆菌(E．coli)内进行发酵， 扩大培养，以期为它的产业化高密度培养和实际工 经分离纯化得到重组蛋 白，命名为类人胶原蛋 白 业应用打下基础。 (Human—likecollagen，简称HLC) 。该重组蛋 白不 仅保留了胶原蛋白原有的功效，而且经修饰后的三 1 材料与方法 重螺旋结构赋予其在分子量不变的条件下优于动物 源胶原蛋 白独特的化学结构和功能 (热可逆成胶 1．1 供试菌种 性、水溶性、低免疫排异反应)，具有更好的生物相 基 因工 程 菌 Escherichia coliBL21，质 粒 容性 J、生物降解性和可吸收性，广泛应用于生物 NWCP3，由本实验室构建并在甘油含量为40％的保 医用材料领域 。 存培养基中一70~C保存，卡那霉素抗性，温度诱导， 收稿 日期 ：2008．10-21 基金项 目：国家 自然科学基金资助项 目；国家高技术研究发展计划 “863”计划基金资助项 目