RNAi沉寂肝癌细胞CDK2基因表达及树舌多糖GF辅助作用的研究.pdfVIP

10 中医药生物化学与分子生物学通讯 RN A．沉寂肝癌细胞CDK2基因表达及树舌多糖GF 辅助作用的研究 于英君宋高臣 (黑龙江中医药大学哈尔滨 150040) 1目的 构建针对CDK2的siRNA真核表达载体，转染肝癌细胞株SMMC7721，研究其对肝 对其的辅助作用。 2方法 用基因克隆技术构建针对CDK2基因的siRNA真核表达载体，阳离子脂质体试剂法转 染肝癌细胞株SMMC7721，实时荧光定量PCR与Westernblot技术检测对CDK2基因的抑 制效果并筛选出有效siRNA序列片段：并用实时荧光定量PCR技术研究RNAi抑制CDK2 体外对SMMC7721细胞增殖抑制情况并筛选出体外抗瘤的有效树舌多糖GF剂量；并采用 实时荧光定量PCR与Westernblot技术研究树舌多糖GF对肝癌SMMC7721细胞CDK2、 3结果 3·lDNA测序证明成功构建针对CDK2基因的siRNA真核表达载体。 3·2阳离子脂质体转染法成功将外源表达载体转入SMMC7721细胞，转染效率达90％ 以上。 CTAATAT与191：GACCCTAACAAGCGGATll℃G。 3·4 基因蛋白水平的抑制率分别为91．6％、79．5％。 3·5 达上调56％，191片段可使CyclinE与E2F1基因mRNA表达分别下调36％、38％。 3-6树舌多糖GF 2．5lag·ml～、5峙·ml～、10lag·ml以对肝癌细胞增殖有明显抑制作用，抑 制率分别为20．0l％、20．47％、24．44％。 3·7树舌多糖GF 水平下调，使RB基因mRNA表达水平上调。 3·8树舌多糖GF 10119·ml。1与190序列合用使CDK2蛋白表达比单纯190抑制提高 47．1％；树舌多糖GF mRNA表达比单纯191抑制提高 2．5嵋·ml。1与191序列合用使CDK2 3％，蛋白表达比单纯191抑制提高13．3％。 4结论 中医药生物化学与分子生物学通讯 4·l经DNA测序证明，成功构建6对以CDK2为靶基因的siRNA真核表达载体。 4·2通过RNAi能特异地沉寂肝癌细胞中CDK2基因，表明CDK2基因可能成为肝癌 基因治疗中的一个新的靶点。 的依赖性，表明对细胞周期调控网络中CDK2基因的干扰抑制是肝癌基因治疗的有效手段 之一。 4·4树舌多糖GF对体外肝癌细胞株SMMC7721的增殖有明显抑制作用，机制可能是 通过下调CDK2、CyclinE与E2F1基因表达，上调RB基因表达实现的。 4·5树舌多糖GF对RNAi沉寂CDK2基因表达有一定辅助作用，表明树舌多糖GF可 以成为肝癌基因治疗中的一个新的辅助药物。 关键词CDK2：RNAi：树舌多糖GF：siRNA；SMMC7721 Object ToConstructthesiRNA CDK2 eukaryotic gene， expressionplasmids(pGPU6／GFP／Neo)of to in its thentransfectthehuman carcinomacellsline(SMMC7721)．For hepatoeellular studying effectontheCDK2andtherelated EandE2FI inthecell