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实 用 技 巧 分光光度计的应用常识 分光光度计已经成为现代分子生物实验室常规仪器。常用 事实上，分光光度计的设计原理和工作原理，允许吸光值在 于核酸，蛋白定量以及细菌生长浓度的定量。 一定范围内变化，即仪器有一定的准确度和精确度。如 Eppendorf Biophotometer 的准确度 ≤ 1.0%（1A ） 。这样 分光光度计的简单原理 多次测试的结果在均值1.0%左右 之间变动，都是正常的。 分光光度计采用一个可以产生多个波长的光源，通过系 另外，还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的 列分光装置，从而产生特定波长的光源，光源透过测试的样 pH 值，离子浓度等：在测试时，离子浓度太高，也会导致 品后，部分光源被吸收，计算样品的吸光值，从而转化成样 读数漂移 ，因此建议使用 pH 值一定、离子浓度较低的缓冲 品的浓度。样品的吸光值与样品的浓度成正比。 液，如 TE，可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽 视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其 核酸的定量 是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程 核酸的定量是分光光度计使用频率最高的功能。可以定 度减少颗粒对测试结果的影响， 要求核酸吸光值至少大于 量溶于缓冲液的寡核苷酸，单链、双链 DNA，以及 RNA。核 0.1A ，吸光值最好在0.1-1.5 A 。在此范围内，颗粒的干扰 酸的最高吸收峰的吸收波长 260 nm。 相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或 每种核酸的分子构成不一，因此其换算系数不同。定量 者过高（超过光度计的测试范围）。最后是操作因素，如混 不同类型的核酸，事先要选择对应的系数。如：1OD 的吸光 合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存 值分别相当于 50μg / ml 的 dsDNA，37μg / ml 的 ssDNA， 在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相 40μg / ml的RNA，30μg / ml 的Olig。测试后的吸光值经过上 同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系 述系数的换算，从而得出相应的样品浓度。测试前，选择正 数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样 确 的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样 品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。 品液。 然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最 头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。 8 实 用 技 巧 No. 2 除了核酸浓度，分光光度计同时显示几个非常重要的比 显色基团或者染料反应，产生有色物质。有色物质的浓度与 值表示样品的纯度，如 A 260 / A 280 的比值，用于评估样品 蛋白质反应的氨基酸数目直接相关，从而反应蛋白质浓度。 的纯度，因为蛋白的吸收峰是 280 nm。纯净的样品，比值 比色方法一般有 BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。 大于 1.8（DNA）或者 2.0（RNA）。如果比值低于 1.8 或者 Lowry 法：以最早期的 Biuret 反应为基础，并有所改进。蛋 2.0，表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A 230 表示样品