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第四部分质量规格要求、生产使用工艺和检测方法，食品中添加剂的检验方法或者相关情况说明4.1 质量规格要求名称：蛋白酶 来源：枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis供体：解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens本产品符合GB 25594-2010《食品安全国家标准 食品工业用酶制剂》的要求。4.2 生产工艺生产工艺：以转基因枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis生产菌在严格控制的条件下进行液体深层发酵，经提取、复配等工艺制备而成的蛋白酶(以下简称蛋白酶制剂)。4.2.1 发酵蛋白酶制剂是通过经基因修饰的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis深层分批纯培养发酵生产。4.2.1.1发酵原料生产菌株在一种由多种化合物组成的培养基中生长，培养基的化合物提供了满足菌株生长所需的碳源、氮源、矿物质以及维生素。发酵工艺中（种子培养、种子罐、主发酵以及补料）所使用的原料如下所列：碳水化合物（如：蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、淀粉水解物）植物性蛋白（如：马铃薯蛋白、豆粕、玉米浆）酵母提取物柠檬酸氨尿素盐类（如：硫酸镁、磷酸氢二钾、硫酸铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠）维生素 微量金属 调节pH值用的碱和酸 消泡剂（需要时使用）饮用水4.2.1.2 发酵环境的控制所有设备均经过谨慎地设计与构建，以防止外源性微生物的污染。所有发酵工艺中未使用的阀门和连接装置，均在120°C以上的蒸汽中密封保存。高压灭菌后，发酵罐内气压维持在正压大于0.2个大气压。将通风用空气通过一无菌滤器，对其进行灭菌。在每个发酵工艺之间，使用高压喷水器仔细清洗每个发酵罐的内侧，并在清洗过程完成后进行检查。4.2.1.3 菌种保藏生产菌株冻干保存或在甘油中于-80°C保存。接种之前，生产菌株的原种培养物按照下列参数进行质量控制：a) 菌种确认b) 无污染微生物c) 活菌数d) 产酶能力4.2.1.4 接种准备装有菌种培养基的接种瓶经高压灭菌并严格控制，只有经认可的瓶子可用来接种。生产菌株的培养物悬浮液无菌注入接种瓶中，并使其散布到琼脂培养基中。在接种瓶中培养菌种，控制参数如下表所列。表2 接种瓶工艺操作控制参数操作种子培养基配置菌种确定使用的小瓶编号登记在接种瓶上，并有文件记录。生长条件接种瓶在约37C条件下存放1-3天微生物分析对接种瓶进行微生物控制种子转移标准菌种充分生长；通过微生物分析当获得足够数量的微生物，并通过微生物分析测试后，接种瓶可以用于接种种子罐。4.2.1.5 种子发酵将培养基原料加水在不锈钢容器中混拌后加入种子罐，加热灭菌。接种瓶中的细胞悬浊液经无菌管道和专用连接口转移到种子罐中。种子发酵控制参数如下表所示。表3 种子发酵罐工艺操作控制参数操作培养基配制调整重量调整和登记所用的培养基原料灭菌培养基灭菌，例如大约123℃热处理最少45分钟。灭菌后分析测量RI % 和pH值。需要时调节pH值。发酵温度在明确的温度下发酵搅拌使用强烈搅拌通气培养基由灭菌空气通气压力压力始终保持在0.2个大气压以上干物质定时测定RI %微生物分析在接种和种子转移之前严格控制样品种子转移标准菌种充分生长；通过微生物分析注：RI：折射率4.2.1.6 主发酵罐中发酵将培养基原料与水在混合罐中进行混拌后，转移到主发酵罐，在主发酵罐中加热灭菌。当培养物在种子发酵罐中旺盛生长时，将培养物经无菌操作转移至主发酵罐。通过标准的深层分批发酵法，在主发酵罐中进行发酵。主发酵罐的控制参数如下表所示。表4 主发酵罐工艺操作控制参数操作培养基配制调整重量调整和登记所用的培养基原料灭菌培养基灭菌，例如大约123℃热处理最少45分钟。灭菌后分析测量RI % 和pH值。需要时调节pH值。发酵温度在明确的温度下发酵搅拌使用强烈搅拌通气培养基由灭菌空气通气压力压力始终保持在0.2个大气压以上pH值控制并调节开始补料pH大于设定点，并增加溶氧补料速率控制并调节补料速率，避免碳水化合物积累分析pH值和RI %值每隔一段时间测定一次酶活力酶活力每隔一段时间测定一次微生物分析在接种之前和发酵过程中，样品要严格控制4.2.1.7微生物控制从种子发酵罐和主发酵罐中取样：1) 接种之前；2) 培养过程中定期；3) 转移或收集之前。所有步骤中样品的检查项目包括：1) 显微镜检查；2) 培养物接种至营养琼脂平板，并培养24至48小时。通过肉眼和显微镜观察其生长特征。微生物控制步骤中，必须控制外源性微生物的量。发酵参数，如酶活力和pH值应密切监测。偏离正常的发酵工艺可能意味着有染菌。如果出现严重染菌，则停止发酵工艺。“严重染菌”的表现为：两个独立样品在营养琼脂上出现了污染微生物。　任何染菌的发酵批次不能用于食品级蛋白酶的生产。4.2.2 提纯提纯是一个多步骤操作过程，目的在于从发酵液中分离