应用RNA干涉技术阻断EBV潜伏期基因LMP1表达的实验研究.pdf

应用RNA干涉技术阻断EBV潜伏期基因LMPl表达的实验研究 中文摘要 g印 RNAi逆转录病毒载体，并筛选出稳定产毒的细胞克隆，探讨uⅥP1特异性沉默对 EBv阳性细胞凋亡的影响。 hairpinRNA，shRNA)的寡核苷酸序列定向克隆人逆转录病毒载体 psuPER．re仃o．neog龟，并用限制性内切酶酶切鉴定以及测序鉴定；脂质体法将重 组逆转录病毒载体转染包装细胞系PA317，G418筛选获得稳定产生逆转录病毒的 细胞克隆；收集病毒上清，感染靶细胞Raji；采用RT-PcR检测靶基因LMPl的 沉默效果，流式细胞术检测Raji细胞的凋亡。 结果①酶切鉴定及测序鉴定结果表明插入片段的序列和方向完全正确；② 重组载体转染包装细胞，可表达绿色荧光蛋白，经G418筛选，得到抗性细胞克隆； ③RT-PcR结果表明psuPER．re咖．neog印RNAi逆转录病毒可有效抑制Raji细胞 中LMPl的表达，流式细胞仪检测表明州P1沉默可导致R硪细胞凋亡，同时用 细胞凋亡诱导剂TGF．B1处理时更为明显。 re仕oRNAi 结论成功构建了特异性沉默EBV潜伏期基因ⅢPl的psuPER 逆转录病毒载体，并筛选出稳定产毒的细胞克隆，初步实验结果表明逆转录病毒 载体介导的RNA干涉能有效沉默靶基因uⅥP1的表达，并能诱导LMPl阳性细胞 Raji的凋亡，为深入探讨ⅢPl基因特异性沉默对EBV阳性肿瘤的治疗作用奠定 了实验基础。 硕士研究生 殷凡(病原生物学) 指导导师 罗兵 教授 关键词： 小发夹RNA；潜伏膜蛋白基因l；PA317；psuPER．retmRNAi逆转录 病毒载体；EBv RNAIntcrferenceforlnh_bjtionofEBVLatentMembraneGeneI—MPl Expressjon AbstJ．act Tb constnlctarecombinantretmviralvector EBV objectiVe psuPER—LMPlthat ta唱et latentmembrane selectastable cell pmteingenel(LMPl)and cloⅡe， Vims-producing to the ofEBV the was Rajjcell(LMP】+)aner exPJol-eap叩tosis posi“Ve ta曙etgene sikncedRNAi． by MethodsThe60nt encodedfor LMPl were shRNAclonedinto sequences transc曲ing aretr0VimalVector wi血DNArecombinant recombinant