RNA提取分析课件.pptVIP

* * 上层水相含有RNA，中间层为基因组DNA，下层有机相含有蛋白，多糖等杂质。这样我们可以通过不同的方法分别提取得到RNA，DNA和蛋白。 过渡词：我们如何来分离纯化上层水相中的RNA呢？ 这里有两种方法：一种是传统方法，沉淀法；另外一种方法是试剂盒中常用到的-柱纯化法。传统方法也就是将得到的上层水相加入等体积的异丙醇来沉淀RNA，然后用70%的乙醇洗涤沉淀，最后晾干溶解得到RNA溶液。这种方法的特点就是得率高。 柱纯化法是采用吸附柱来特异性地吸附RNA，通过漂洗去除杂质，最后用洗脱液将结合在吸附柱上的RNA洗脱下来。这种方法最大的特点就是得到的RNA纯度高。 过渡词：我们天根公司生产的RNAultra就是采用的柱纯化法来分离提纯RNA的。 S17：这是用RNAultra来柱纯化RNA的一个流程示意图：我们将上层水相吸到一个含有吸附柱的EP管中，RNA就吸附结合在硅质膜上，然后加入去蛋白液除蛋白，漂洗液除盐，最后用洗脱缓冲液将RNA从吸附柱上洗脱下来。 RNA提取 RNA提取的基本原则 总原则 1.保证核酸一级结构的完整性 2.尽量排除其他成分的污染 完整RNA的提取和纯化,是进行RNA方面的研究工作,如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。 提取细胞总RNA的 原理与方法 破碎细胞 去除 大分子杂质 去除蛋白质、 脂类、DNA等 沉淀RNA 同时去除盐类、 有机溶剂 进一步纯化RNA 常规步骤 RNA提取流程－－细胞裂解，以释放RNA 异硫氰酸胍/酚－TRizol总RNA提取试剂 胍盐/β-巯基乙醇—RNAprep系列RNA提取试剂盒 本来Trizol是一个专利的品牌，最早是MRC实验室的科学家发明的方法，后来把专利卖给了Invitrogen/Gibco， Invitrogen/Gibco将此方法推广到世界,目前使用甚广。 Trizol（异硫氰酸胍-苯酚法） 由苯酚和硫氰酸胍等配制而成的单相的快速抽提试剂 可在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性 在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA Trizol可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。如果细胞量过少或组织来源特异，可以采用相应试剂盒提取RNA。 Trizol（异硫氰酸胍-苯酚法） 异硫氰酸，β-巯基乙醇，SDS裂解细胞 酸性条件（pH4.0)下酚、氯仿抽提，离心，蛋白质，DNA和脂质进入有机相，而RNA存在于水相 异丙醇沉淀水相中的RNA Trizol法的原理 可在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性 实验步骤如下： 1. 取50~100mg的组织,加入1 ml Trizol试剂，用匀浆器打匀(Trizol 先放于冰上)。 2. 将匀浆室温放置5 min。 3. 加入200 μl 氯仿,剧烈震荡混匀30s，冰上静置3 min。 4. 12000 rpm，4℃ 离心15 min。 5. 将上清液小心转移到新的1.5 ml离心管中（取400 μl ），加入等量体积的异丙醇，上下颠倒几次混匀，室温下放置15 min。（此步中注意：不要吸取任何中间层物质，宁缺勿烂。） 6. 12000 rpm， 4℃ 离心15 min 。 7. 小心移去上清液，防止RNA沉淀丢失。 8. 用70%乙醇（DEPC处理的水配制）洗涤1次，加入700 μl乙醇，将RNA沉淀弹起，漂洗。（此时RNA是不溶解的） 9. 8000 rpm，室温离心10min。 10. 尽可能彻底地吸走上清，防止RNA沉淀丢失。 11. 真空离心干燥3~5分钟，或放在室温下使乙醇完全挥发掉。 12. 沉淀用30 μl DEPC-H2O溶解。如发现沉淀难溶，68 ℃处理10 min。 细胞 基因组DNA 水相 有机相 RNA 氯仿 纯化 pH5.7 离心 加入裂解液 (TRNzol-A+) 细胞选择 贴壁细胞 悬浮细胞 TRNzol-A＋试剂法提取——提取动物培养细胞 等体积异丙醇沉淀 75％乙醇洗涤沉淀 晾干溶解 RNA吸附柱 去蛋白液 漂洗 洗脱 水相 RNA 传统方法：有机溶剂抽提，得率高 柱纯化法：纯度高 TRNzol-A＋试剂法提取——提取动物培养细胞 操 作 流 程 样品前处理、细胞裂解 试剂 试剂盒 抽提 沉淀 加入吸附柱 洗涤 溶解RNA沉淀 获得RNA产物 加去蛋白液 和DNaseI 漂洗 RNA洗脱收集 * 上层水相含有RNA，中间层为基因组DNA，下层有机相含有蛋白，多糖等杂质。这样我们可以通过不同的方法分别提取得到RNA，DNA和蛋白。 过渡词：我们如何来分离纯化上层水相中的RNA呢？