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非洲猪瘟病毒蛋白p54原核真核表达、间接ELISA检测方法建立及单克隆抗体制备.pdf 92页

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暨南大学硕士学位论文 题名(中英对照): 非洲猪瘟病毒蛋白p54 原核真核表达、间接ELISA 检测方法建 立及单克隆抗体制备 The Prokaryotic and Eukaryotic Expression of ASFV Protein p54, Development of Indirct ELISA Method and Generation of p54 Monoclonal Antibody 作者姓名:梁云浩 指导教师姓名及学位、职称:唐勇 副研究员 学科、专业名称:理学 生物化学与分子生物学 论文提交日期:2014 年5 月20 日 论文答辩日期:2014 年6 月4 日 答辩委员会主席: 论文评阅人: 学位授予单位和日期: 独 创 性 声 明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果,也不包含为获得 暨南大学 或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名: 签字日期: 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解 暨南大学 有关保留、使用学位论文的规 定,有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘,允许论文被查 阅和借阅。本人授权 暨南大学 可以将学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 (保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名: 导师签名: 签字日期: 年 月 日 签字日期: 年 月 日 学位论文作者毕业后去向: 工作单位: 电话: 通讯地址: 邮编: 暨南大学硕士学位论文 摘要 目的:利用PET 原核表达系统和pFastBac / NT-TOPO 真核表达系统分别表 达出非洲猪瘟病毒蛋白p54 ,建立检测非洲猪瘟血清抗体的间接ELISA 方法。同 时制备p54 的单克隆抗体。 方法:将非洲猪瘟病毒蛋白 p54 的基因克隆到原核表达载体 pET-52b(+)3C/LIC 上,再转入大肠杆菌BL21(ED3) 中,获得重组表达蛋白p54 。 超声破碎菌体,取离心后上清进行SDS PAGE 和Western blot 分析。优化诱导表 达条件,利用表达蛋白上的六组氨酸标签进行蛋白纯化,获得高纯度的p54 。将 纯化后的p54 包被酶标板,建立检测非洲猪瘟血清抗体的间接ELISA 方法。 将非洲猪瘟病毒蛋白 p54 基因克隆到真核载体pFast/NT-TOPO 上,转入大 肠杆菌DH 5 α中,扩大培养后涂布抗生素筛选平板,挑取生长的单克隆菌落获 得重组质粒,经PCR 鉴定正确后,转入大肠杆菌DH10 Bac 中,获得重组杆状 病毒质粒。利用脂质体介导,获得重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染sf9 细胞, 72 h 后收集细胞,超声破碎,取离心后上清进行SDS和Western-blot 分析。 用上清包被酶标板,建立检测非洲猪瘟血清抗体的间接ELISA 方法。 用原核表达的p54 免疫小鼠,用真核表达的p54 进行杂交瘤细胞筛选,采用 传统化学融合和有限稀释法制备出p54 的单克隆细胞株。 结果:真核、原核表达系统均表达出非洲猪瘟病毒蛋白p54 ,经Western-blot 分析,重组蛋白可以和标准阳性血清反应,有良好反应性。基于原核/真核表达 p54 的间接ELISA 方法,可以分别检测出 1:1280 和 1:320 倍稀释的标准阳性血 清。批内、批间变异系数分别小于10%和15%。检测96 份血清样品与商品化试 剂盒的符合率分别为 90.1%和 84.4% 。检测的灵敏性均为 1

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