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军犬细小病毒病原分离及分型研究 军犬细小病毒病原分离及分型研究 邱薇梁秀胡挺松郑颖范泉水冯子良陈刚 (成都军区疾病预防控制中心，云南昆明650118) 摘要：为查明4份疑为细小病毒病的军犬的病原及其特性，为进一步的免疫研究奠定 基础。将4份送检的犬肠道内容物过滤后分别接种猫肾细胞(F81)，培养5天后，未出 现细胞病变的带毒盲传。同时提取病料的总DNA，用犬细小病毒的VP2特异性引物进行 及系统发育分析。结果用FSl细胞分离到4株细小病毒，经VP2基因比对分型表明，4株 关键词：犬细小病毒；分离；VP2基因；分型 犬细小病毒(Canine Tmyen，2006)，是继 血性肠炎的犬腹泻粪便中分离得到，被命名为CPV一2(]Uwe of virus (Minule 种年龄的犬都能感染，可引起犬出血性肠炎和心肌炎，并使白细胞数大量减少，在幼犬 中的发病率和死亡率都很高，症状与猫泛白细胞减少症相似。本病虽发现时间不长，但 当前已在世界范围内广泛流行，成为犬的一种重要传染病，给养犬业造成了极大的危害。 1980年该病传人我国，并很快传遍军犬、警犬、实验犬等所有犬群，引起大批死亡，严 重影响我国养犬事业的发展。CPV被认为是猫泛白细胞减少症病毒(Fehnepanleukopenia C 几年时间内已发生了抗原漂移，在抗原性、宿主范围和血凝性上都发生了变化(Parrish CR等，1991； Ikeda Y等，2000)。由于CPV的变异速度快，使现在使用的弱毒疫苗的免疫效果有所下 降，因此，有必要对现在流行的CPV毒株进行分型，研究其进化和变异规律，为今后制 备更有效的疫苗奠定理论基础。 本研究对昆明某基地不同时间送检的4份出现血便且发病死亡的不同犬种的病料逐一 进行了细小病毒分离、VP2基因扩增及序列分析，经序列比较证实4次分离的细小病毒株 均属CPV一2a型，可能为同一株细小病毒株。现报告如下。 】09 2013年第十五次全国养犬学术研讨会暨第七次全国小动物医学学术研讨会论文集 1材料和方法 1．1材料 1．1．1病料、试剂及细胞病料为犬肠道，由昆明某基地送检，经CPV抗原检测试纸 条检测为阳性。Taq酶及其它分子生物学试剂购自上海生工生物工程公司，猫肾细胞(F 一81细胞)由成都军区疾病预防控制中心实验室保存。 由宝生物工程(大连)有限公司合成，其中PI／P2引物序列扩增VP2基因的169bp一1 227 755 bp一1 bp之间的序列 014bp之间的序列片段，P3／P4引物序列扩增VP2基因的1 片段，其中用一对引物可以用于细小病毒的鉴定，用两对引物分别扩增细小病毒的不同 片段才能将细小病毒关键的几个突变位点包括完全： P1：5’一GGATGGGTGGAAATCACAG一3’ P2：5’一ATAACCAACC‘rcAGCTGGT一3’ P3：5’一TCCAGAAGGAGATGGGAYr一3’ P4：5’一CCAACCAACCACCCACACCAT一3’ 1．2方法 1．2．1病毒分离取肠炎犬的肠道内容物，用等体积的灭菌水稀释，上下颠倒充分混 匀，12000g，离心10min，取上清，经0．2“m微孔滤膜过滤后，一20℃冻存备用。猫肾 F81细胞按常规方法消化传代，用与细胞传代同步的接毒方式(张亚成等，2010)，按培 min，加生长液继续于37。C，5％二 养液量体积的1／10接人待分离的样品，37。C吸附